Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)Aβ-,31-35-神經(jīng)毒的作用觀察.pdf

1、阿爾茨海默病(AlzheimerDisease，AD)是一種以記憶減退、認(rèn)知障礙、以及進(jìn)入癡呆狀態(tài)為特征的腦退行性疾病。其病理改變?yōu)榇竽X皮層和海馬等腦區(qū)出現(xiàn)大量的老年斑(senileplaque,SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibirilarytangle,NFT)以及神經(jīng)元的大量丟失。β淀粉樣蛋白(β-amyliod，Aβ)是老年斑的主要成份，越來越多的研究表明，Aβ的大量沉積是誘發(fā)AD主要病理改變和臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵因素之一。研究證

2、實(shí)，Aβ以及人工合成的各種Aβ片斷，如Aβ1-42和Aβ25-35，都可誘發(fā)細(xì)胞凋亡；近年來，本研究室及其他研究者的工作證實(shí)，一個(gè)更小的Aβ片段Aβ31-35也具有與完整肽鏈或Aβ25-35類似的神經(jīng)毒作用，可能是Aβ肽鏈中最短的活性序列。 谷氨酸(Glu)是腦內(nèi)主要的興奮性遞質(zhì),Glu受體可分為離子型谷氨酸受體(inotropicglutamatereceptors，iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic

3、glutamatereceptors，mGluRs)。前者包括NMDA、AMPA及KA受體等離子通道結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞；后者屬G蛋白耦聯(lián)受體家族，根據(jù)其氨基酸序列的同源性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和藥理學(xué)特性的不同，將其分為三組：Ⅰ～Ⅲ組mGluRs。其中Ⅰ組包括mGluR1和mGluR5，主要通過活化PLC產(chǎn)生IP3和DG發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，前者通過引起胞內(nèi)Ca2+釋放引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，后者通過激活PKC發(fā)揮作用。Ca2+升高形成的C

4、a2+信號在胞內(nèi)可引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)，而Ca2+超載是病理情況下引起神經(jīng)損傷的重要機(jī)制。因此，Ⅰ組mGluRs的生物學(xué)作用尤其是在病理情況下的作用備受關(guān)注，而現(xiàn)有報(bào)道卻大相徑庭，既有Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)神經(jīng)毒作用的報(bào)道，又有他們拮抗神經(jīng)毒發(fā)揮保護(hù)作用的報(bào)道。此外，有關(guān)Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35神經(jīng)毒作用的影響未見報(bào)道。因此，本研究利用培養(yǎng)神經(jīng)元致凋亡模型[Ca2+]i測定等技術(shù)觀察Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35致神經(jīng)元凋亡作用的

5、影響。 研究方法包括利用透射電鏡、AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和TUNEL染色法檢測培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡，利用離子成像法觀察培養(yǎng)皮層神經(jīng)元[Ca2+]i的變化，利用酶聯(lián)免疫法檢測Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的活性。首先應(yīng)用Ⅰ組mGluRs激動(dòng)劑DHPG、特異性mGluR1拮抗劑CPCCOEt和特異性mGluR5拮抗劑MPEP，觀察Ⅰ組mGluRs是否介導(dǎo)了Aβ31-35對原代培養(yǎng)皮

6、層神經(jīng)元的致凋亡作用，檢測Aβ31-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否伴有鈣超載，并通過測定凋亡過程caspase系統(tǒng)活性的改變，分析Aβ致凋亡和有關(guān)的拮抗劑，激動(dòng)劑作用是否通過凋亡的外源性或內(nèi)源性途徑實(shí)現(xiàn)；并且應(yīng)用PKC抑制劑BMI觀察Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)Aβ31-35的作用是否通過PKC信號通路。從而闡明Ⅰ組mGluRs在Aβ31-35致原代培養(yǎng)神經(jīng)元毒性過程的作用，為深入了解Ⅰ組mGluRs的生物學(xué)作用及Aβ31-35的神經(jīng)毒作用提供進(jìn)一步的

7、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)Aβ31-35誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用觀察。本部分實(shí)驗(yàn)在Aβ31-35引起小鼠皮層神經(jīng)元凋亡的基礎(chǔ)上，觀察Ⅰ組mGluRs激動(dòng)劑DHPG和特異性mGluR1拮抗劑CPCCOEt和mGluR5拮抗劑MPEP對Aβ31-35致凋亡作用的影響。 第二部分Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元[Ca2+]i變化的作用觀察。研究證實(shí)，[Ca2+]i升高在各種原因所致的細(xì)胞損傷包括細(xì)胞凋

8、亡中發(fā)揮非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室以往的觀察及本研究前期的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，Aβ31-35可引起神經(jīng)元凋亡，同時(shí)第一部分實(shí)驗(yàn)又證實(shí)Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)了Aβ31-35的致凋亡作用。為證實(shí)Aβ31-35對培養(yǎng)皮層神經(jīng)元[Ca2+]i的作用以及Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35誘導(dǎo)的[Ca2+]i變化的影響，我們利用生后1天的大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，以Ca2+指示劑Fura-2作為[Ca2+]i的熒光探針，利用離子成像技術(shù)在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進(jìn)行觀察。

9、并通過計(jì)算F340/F380值，定量反映[Ca2+]i變化的幅度和動(dòng)態(tài)變化過程，以期證實(shí)：1)Aβ31-35對培養(yǎng)皮層神經(jīng)元[Ca2+]i的作用；2)Ⅰ組mGluRs激活對培養(yǎng)皮層神經(jīng)元[Ca2+]i的作用及機(jī)制探討；3)Ⅰ組mGluRs激活對Aβ31-35所致皮層培養(yǎng)神經(jīng)元[Ca2+]i變化的影響。 第三部分Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)Aβ31-35誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制探討。前兩部分的研究結(jié)果顯示，Aβ31-35可致培養(yǎng)皮層神經(jīng)

10、元凋亡及[Ca2+]i升高，同時(shí)證實(shí)利用DHPG激活Ⅰ組mGluRs可致神經(jīng)元凋亡及[Ca2+]i升高，此外DHPG還具有增強(qiáng)Aβ31-35致神經(jīng)元凋亡和升高[Ca2+]i的作用。又由于Ⅰ組mGluRs既可通過IP3引起Ca2+釋放也可通過DG激活PKC發(fā)揮作用。因此，為探討Ⅰ組mGluRs介導(dǎo)Aβ31-35神經(jīng)毒性作用的機(jī)制，我們利用生后1天的大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，用AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察PKC抑制劑BMI對Ⅰ組m