蝎毒神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)活性肽抗癲癇作用的研究.pdf

1、目的：癲癇癥(Epilepsy，EP)是常見多發(fā)的慢性腦部疾患之一，其發(fā)病機(jī)制目前并不十分清楚。但其發(fā)作的電生理本質(zhì)都是腦部神經(jīng)元過度同步化放電，從而引起大腦短暫的功能障礙。本病長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，不僅使患者體軀遭受痛苦，而且在一定程度上導(dǎo)致精神及社會(huì)心理障礙，使其在智能及人格方面均受到損害。正是由于癲癇病的復(fù)雜性、難治性及用藥的多樣性，因此抗癲癇藥物的開發(fā)急需等待突破。
　　 在藥物篩選中，我們發(fā)現(xiàn)東亞鉗蝎(Buthus marte

2、nsi Karsch，BmK)對(duì)難治性癲癇有明顯藥效。全蝎入藥治療癲癇已有幾千年的歷史，其藥效在于蝎尾中的毒液組分蝎毒(scorpion venom，SV)。SV具有明顯的抗癲癇作用，但成分復(fù)雜，毒性很強(qiáng)，使得其臨床應(yīng)用受到很大限制。我室長(zhǎng)期從事蝎毒藥物開發(fā)研究，從蝎毒毒素中提取出具有抗癲癇作用的組分。通過特殊工藝，得到分子量為3177Da的蝎毒神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性肽(scorpion venom neuro-nourishing peptid

3、e，svNNP)(國(guó)家發(fā)明專利：ZL011061669)。與SV粗毒相比，svNNP不僅毒性明顯降低，且抗癲癇作用增強(qiáng)。
　　 因此本研究的主要目的是從整體和細(xì)胞水平進(jìn)一步探討svNNP抗癲癇的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為蝎毒藥物的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：在體大鼠及體外培養(yǎng)神經(jīng)元制備癲癇模型，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、MTT法及Western-Blot等方法多層次，多水平觀察蝎毒神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性肽抗癲

4、癇作用的機(jī)制。
　　 結(jié)果：一、體內(nèi)試驗(yàn)：
　　 氯化鋰(LiCl)-匹羅卡品(PILO)誘導(dǎo)大鼠制備癲癇模型，給予動(dòng)物svNNP，觀察行為學(xué)改變、免疫組織化學(xué)影響，結(jié)果顯示：
　　 1.svNNP給藥組25min內(nèi)癲癇發(fā)作次數(shù)較對(duì)照組減少，但發(fā)作級(jí)別尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5，P＞0.05)，而各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)及空間搜索實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和穿越平臺(tái)的次數(shù)比較無(wú)顯著意義(n=5，P＞0.05)。
　　

5、 2.GFAP免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示svNNP用藥后GFAP陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞突起不規(guī)則，分支多而短曲，表面不光滑，細(xì)胞類型由模型組的纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為用藥組的原漿型星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 3.MAP2免疫組織化學(xué)顯示svNNP給藥組與模型組相比樹突斷裂數(shù)明顯減輕，神經(jīng)元脫失及樹突形狀明顯改善。
　　 二、體外實(shí)驗(yàn)：
　　 1．免疫細(xì)胞化學(xué)：體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，預(yù)孵育SV粗毒和svNNP24h后腦源神經(jīng)生長(zhǎng)

6、因子(brain derived neutrophic factor，BDNF)免疫染色：①膠質(zhì)細(xì)胞BDNF免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：svNNP給藥組與SV粗毒給藥組及正常對(duì)照組相比較BDNF免疫反應(yīng)染色加深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P＜0.01)，染色變深，推測(cè)svNNP可增加膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的表達(dá)。②海馬神經(jīng)元BNDF免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：svNNP預(yù)處理組較對(duì)照組比較神經(jīng)元形態(tài)完好，細(xì)胞之間連接緊密，BDNF免疫反應(yīng)陽(yáng)性染色及免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞明

7、顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 2．細(xì)胞存活能力：MTT法觀察蝎毒提出物對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活的影響，發(fā)現(xiàn)SV粗毒組與正常組相比較OD值明顯降低(P＜0.05)；svNNP組同正常組相比較OD值明顯增高(P＜0.05)。說明svNNP可提高細(xì)胞存活力，而粗毒卻具有毒性作用，降低原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的細(xì)胞存活力。
　　 3．受體門控通道：體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，急性加入NMDA誘導(dǎo)NMDA受體激活電流(INMDA)，觀察不同濃

8、度svNNP(10-3μg/ml、10-4μg/ml、10-5μg/ml、10-6μg/ml、10-7μg/m、10-8μg/ml)對(duì)INMDA的影響，結(jié)果顯示：五種不同濃度的svNNP均能降低海馬神經(jīng)元INMDA(n=8，P＜0.01)，而且具有濃度依賴性。
　　 4．電壓門控鈉通道：采用紅藻氨酸(Kainic acid，KA)制備原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的興奮毒性損傷模型，孵育svNNP24h，結(jié)果顯示：①svNNP可抑制KA預(yù)處

9、理的海馬神經(jīng)元電壓門控鈉通道峰電流。對(duì)照組(n=26)與svNNP組(n=24)相比差異具有顯著意義(P＜0.05)。②svNNP藥物處理組海馬神經(jīng)元電壓門控鈉通道穩(wěn)態(tài)激活曲線發(fā)生變化，10μmol/LKA處理后鈉通道穩(wěn)態(tài)激活曲線的半數(shù)激活電壓V1/2為-40.1±1.80(n=20)，2μg/mlsvNNP+10μmol/LKA處理后V1/2變?yōu)?36.26±1.44(n=19)，KA處理組和KA+svNNP處理組V1/2相比較具有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③藥物不同處理組的海馬神經(jīng)元鈉通道穩(wěn)態(tài)失活曲線亦發(fā)生變化，正常鈉通道半數(shù)失活電壓為-59.03±0.29(n=16)；10μmol/LKA處理后V1/2-61.07±0.43(n=18);給予2μg/mlsvNNP+10μmol/LKA處理后V1/2變?yōu)?64.24±0.97(n=16)。表明2μg/mlsvNNP+10μmol/LKA處理后鈉通道半數(shù)失活電壓左移，與正常對(duì)照組、KA模型組相比差異均具有顯著意義

11、(P＜0.05)。④svNNP用藥后鈉通道從失活中恢復(fù)減慢，與對(duì)照組相比差異具有顯著意義(n=22，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1.svNNP用藥后癲癇大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞由纖維型變?yōu)樵瓭{型。
　　 2.svNNP可改善癲癇發(fā)作所致樹突斷裂及神經(jīng)元脫失。
　　 3.svNNP可增加原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活能力，而SV粗毒卻減低神經(jīng)元存活能力。
　　 4.svNNP可增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的分泌，具有營(yíng)養(yǎng)