2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩101頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:本課題將細(xì)胞移植與基因治療相結(jié)合,構(gòu)建HCN2重組腺病毒載體Ad.HCN2并體外轉(zhuǎn)染豬脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)以構(gòu)建起搏細(xì)胞,并自體移植以有效起搏心室,從而治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯。
   方法:
   (一)豬ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
   獲取實驗豬頸部脂肪組織,0.075%Ⅱ型膠原酶分離得到ADSCs,將ADSCs培養(yǎng)于完全DMEM培養(yǎng)基中,每7

2、2 h換液1次,細(xì)胞融合達(dá)90%傳代培養(yǎng);觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點,繪制細(xì)胞生長曲線并檢測細(xì)胞周期;通過CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-DR和c-kit的流式細(xì)胞儀檢測和免疫熒光染色檢測細(xì)胞表面標(biāo)志;將ADSCs置入成脂肪、成骨、成軟骨、成肝細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化并鑒定分化細(xì)胞的性質(zhì)。
   (二)Ad.HCN2的構(gòu)建及其檢測
   擴(kuò)增目的基因HCN2,構(gòu)建重組質(zhì)粒pShuttleCMV.HCN2

3、并行PCR和基因測序檢測;應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法制備重組腺病毒Ad.HCN;將Ad.HCN2擴(kuò)增、純化并行滴度測定;HeLa細(xì)胞檢測確定其使用安全性;Ad.GFP以不同感染倍數(shù)(multiplication ofinfection,MOI)轉(zhuǎn)染ADSCs后檢測轉(zhuǎn)染效率,確定最佳MOI;檢測Ad.GFP轉(zhuǎn)染ADSCs表達(dá)強(qiáng)度并繪制時間曲線;檢測Ad.HCN2轉(zhuǎn)染ADSCs后細(xì)胞活力與細(xì)胞周期變化;繪制轉(zhuǎn)染Ad.HCN2、Ad.Null以及

4、未轉(zhuǎn)染ADSCs的生長曲線,對比明確Ad.HCN2的安全性。
   (三)Ad.HCN2轉(zhuǎn)染豬ADSCs構(gòu)建起搏細(xì)胞
   Ad.HCN2轉(zhuǎn)染ADSCs后,RT-PCR檢測HCN2 mRNA表達(dá);免疫熒光檢測HCN2通道蛋白表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測HCN2表達(dá)陽性細(xì)胞百分比;Western-blot檢測HCN2蛋白;全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)行電生理學(xué)檢測;分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat'scardiomyocytes

5、,NRCs)并行免疫組織化學(xué)鑒定;聯(lián)合培養(yǎng)ADSCs和NRCs,觀察細(xì)胞搏動情況并記錄收縮頻率;加入異丙腎上腺素后觀察細(xì)胞收縮頻率變化;將Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs與NRCs聯(lián)合培養(yǎng)后,行抗縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)免疫熒光染色。
   (四)起搏細(xì)胞自體移植治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯
   實驗豬植入心臟電子起搏器后,射頻消融希氏束建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯動物模型;于右心室前壁自體移植ADSCs;

6、術(shù)后常規(guī)行體表心電圖和24 h動態(tài)心電圖檢查;分別注射異丙腎上腺素和阿托品以觀察實驗豬心率對神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)性;獲取細(xì)胞移植部位心室肌,分別行HE染色觀察和免疫熒光檢測。
   結(jié)論:
   (一)豬ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
   ADSCs來源廣泛,脂肪組織抽取后殘留于供區(qū)的脂肪組織仍可擴(kuò)增,容易大量獲得,對供區(qū)損傷小。ADSCs的分離效率較其他干細(xì)胞高,擴(kuò)增能力強(qiáng),傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細(xì)胞。AD

7、SCs表達(dá)CD29和CD44,顯示其具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性;ADSCs不表達(dá)CD34、CD45、c-kit,證明其為非造血類細(xì)胞。而其MHCⅡ相關(guān)蛋白HLA-DR近不表達(dá),說明它們具有極少量與移植排斥相關(guān)的抗原分子,提示ADSCs具有免疫逃逸特性,具備異體移植的可能性。成脂、成骨、成軟骨及成肝細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果證明ADSCs是具有多向分化能力的干細(xì)胞。
   (二)Ad.HCN2的構(gòu)建及其檢測
   構(gòu)建的重組腺病毒攜帶目的基因

8、HCN2。HeLa細(xì)胞未出現(xiàn)CPE,說明制備的重組腺病毒中未混有野生型病毒,體外轉(zhuǎn)染安全。MOI=50的Ad.GFP轉(zhuǎn)染率較高,且細(xì)胞狀態(tài)好,為了達(dá)到最佳量效比,后期實驗均選擇MOI=50作為標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染倍數(shù)。Ad.GFP轉(zhuǎn)染ADSCs后,目的基因表達(dá)隨時間改變逐漸增強(qiáng),在7 d左右表達(dá)強(qiáng)度最高,之后隨時間延長逐漸下降。Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs細(xì)胞活力和細(xì)胞周期無變化,Ad.HCN2對ADSCs無毒副作用。
   (三)Ad

9、.HCN2轉(zhuǎn)染豬ADSCs構(gòu)建起搏細(xì)胞
   RT-PCR正實Ad.HCN2轉(zhuǎn)染ADSCs后,細(xì)胞內(nèi)有HCN2 mRNA合成。保溫試驗證實我們提取的RNA樣品純度高,可以滿足進(jìn)一步實驗要求。Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs可表達(dá)HCN2基因。免疫熒光提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有HCN2蛋白表達(dá),其表達(dá)后功能區(qū)域位于細(xì)胞膜。流式細(xì)胞儀檢測提示Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs細(xì)胞膜上HCN2通道蛋白的高表達(dá)。Western-blot檢測結(jié)果說明Ad.

10、HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs后可高效表達(dá)特異性目的蛋白HCN2。全細(xì)胞膜片鉗證實轉(zhuǎn)染細(xì)胞能產(chǎn)生If。ADSCs與NRCs聯(lián)合培養(yǎng),Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs能有效起搏NRCs,并且對神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有良好的反應(yīng)性。聯(lián)合培養(yǎng)后,ADSCs和NRCs之間可形成Cx43。
   (四)起搏細(xì)胞自體移植治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯
   ADSCs自體移植后,起搏細(xì)胞可有效起搏心室。對比實驗組動物體表心電圖QRS波和起搏標(biāo)測QRS波的形態(tài)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論