MTA1參與化療應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌是目前女性中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。隨著乳腺癌研究的深入和治療手段的發(fā)展，該病的預(yù)后正不斷改善。多數(shù)乳腺癌患者在治療后可獲得明顯緩解，即使Ⅲ期乳腺癌患者五年生存率亦可達(dá)到70％左右。但即便如此，患者的長(zhǎng)期生存依然很難做到，而導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的首要因素就是腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此控制腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療相關(guān)的研究中亟待解決的問(wèn)題。
　　化療是乳腺癌治療的常規(guī)手段之一，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用?；熕幬锿ㄟ^(guò)其細(xì)胞

2、毒性作用殺傷腫瘤細(xì)胞，通常用作乳腺癌患者手術(shù)前后的輔助治療，或者作為保守治療方法應(yīng)用于不能接受手術(shù)的患者。但既往有研究表明，化療具有潛在的促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。我們認(rèn)為損傷性的環(huán)境因素可以引起腫瘤的應(yīng)激反應(yīng)，促使腫瘤轉(zhuǎn)移以逃避不利環(huán)境?；熥鳛橐环N強(qiáng)烈的損傷因素，對(duì)于腫瘤來(lái)說(shuō)顯然是一種強(qiáng)烈的應(yīng)激信號(hào)，是否具有刺激腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，值得探討。
　　轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（Metastasis-associated protein1，MTA1）是

3、一個(gè)與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的重要分子，其過(guò)表達(dá)常見(jiàn)于包括乳腺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤，且往往預(yù)示著腫瘤的高級(jí)別、高轉(zhuǎn)移傾向和不良預(yù)后。更重要的是，MTA1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，其表達(dá)明顯受到環(huán)境因素的調(diào)控。損傷性條件如缺氧、紫外線、電離輻射和炎癥等均可誘導(dǎo)MTA1的表達(dá)，而化療對(duì)乳腺癌細(xì)胞中MTA1表達(dá)水平的影響，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此我們希望通過(guò)實(shí)驗(yàn)，觀察化療對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能的影響，分析在此過(guò)程中MTA1表達(dá)水平的變化及其發(fā)揮的作用，將MT

4、A1與化療后乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變聯(lián)系起來(lái)。
　　目的：
　　通過(guò)觀察化療藥物表柔比星處理前后乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，分析化療對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能的影響。通過(guò)比較表柔比星處理前后乳腺癌細(xì)胞中MTA1的表達(dá)水平，以及在抑制MTA1表達(dá)后觀察表柔比星處理效應(yīng)的變化，分析MTA1在化療造成的乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為改變中發(fā)揮的作用。通過(guò)對(duì)乳腺癌小鼠模型給予表柔比星處理，觀察體內(nèi)化療對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法；

5、　　1.對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231給予半數(shù)抑制劑量的表柔比星處理6h或12h，用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)分析化療對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　2.提取表柔比星處理組和未處理組細(xì)胞的總RNA和蛋白，通過(guò)Real-time PCR和Western blot分析表柔比星處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞中MTA1表達(dá)水平的影響。
　　3.用無(wú)意義的NC siRNA或MTA1特異性siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-

6、MB-231細(xì)胞，通過(guò)Real-time PCR和Western blot分析轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)MTA1表達(dá)水平的影響。
　　4.將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞各分為四組，Control組為正常對(duì)照，Epi組接受6h表柔比星處理，Epi+ NC siRNA組預(yù)轉(zhuǎn)染NC siRNA后接受6h表柔比星處理，Epi+ MTA1 siRNA組預(yù)轉(zhuǎn)染MTA1特異性siRNA后接受6h表柔比星處理。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell

7、實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀察MTA1抑制后表柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響是否發(fā)生改變。
　　5.建立小鼠4T1乳腺癌模型，實(shí)驗(yàn)組小鼠給予3mg/kg較低劑量表柔比星化療，對(duì)照組小鼠給予生理鹽水，每周給藥1次，持續(xù)3周。比較兩組小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，分析動(dòng)物體內(nèi)化療對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能的影響。
　　結(jié)果：
　　1.劃痕實(shí)驗(yàn)中，表柔比星6h處理組的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，與對(duì)照組相比劃痕愈合距離顯著增加

8、。Transwell實(shí)驗(yàn)中，6h處理組的MDA-MB-231細(xì)胞與對(duì)照組相比穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加。12h處理組細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這些效應(yīng)。MCF-7細(xì)胞難以有效穿膜，transwell實(shí)驗(yàn)并未取得有意義的結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再考察MCF-7細(xì)胞的侵襲性。
　　2.表柔比星處理后的MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞均表現(xiàn)出MTA1 mRNA水平和蛋白水平的增高。
　　3.與對(duì)照組和無(wú)意義NC siRNA組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染MTA1特

9、異性siRNA可以顯著降低MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中MTA1的mRNA水平和蛋白水平。
　　4.在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)中，與Control組細(xì)胞相比，Epi組/Epi+ NC siRNA組細(xì)胞的劃痕愈合距離顯著增加；與Epi組細(xì)胞相比，Epi+ MTA1 siRNA組的劃痕愈合距離顯著減少。在MDA-MB-231細(xì)胞的transwell實(shí)驗(yàn)中，Epi組/Epi+ NC siRNA組穿膜細(xì)胞

10、數(shù)顯著多于Control組，Epi+ MTA1 siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于Epi組。
　　5.在4T1乳腺癌小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，相比于對(duì)照組，給予表柔比星化療的實(shí)驗(yàn)組小鼠有更多的肺表面轉(zhuǎn)移灶形成。
　　結(jié)論：
　　1.表柔比星處理可以在體外實(shí)驗(yàn)中增加乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這一效應(yīng)受到藥物處理時(shí)間的制約。處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，無(wú)法觀察到該效應(yīng)。
　　2.表柔比星處理可以顯著提高乳腺癌細(xì)胞中MTA1