多腫瘤標志物診斷模式的建立和新型電化學免疫傳感器的研制.pdf

1、世界衛(wèi)生組織指出,如能早期診斷并及時治療,95％的腫瘤可以治愈。腫瘤標志物在腫瘤普查、診斷、判斷預后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實用價值。隨著現(xiàn)代生物技術(包括蛋白質組、ELISA、RT-PCR、FISH和SELDI-TOF等)的飛速發(fā)展,發(fā)現(xiàn)了許多有應用前景的腫瘤標志物。目前臨床應用的標志物達到20左右,但因單項腫瘤標志物敏感度和特異度較低,無法準確診斷腫瘤和預測預后。國內外研究表明,多腫瘤標志物聯(lián)合動態(tài)檢測是提高腫

2、瘤診斷可行性策略。目前臨床上常用的多腫瘤標志物蛋白芯片檢測(C-12蛋白芯片),含有12種(糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9,CA19-9),神經元特異性烯醇化酶(neuron specificenolase,NSE),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),糖類抗原242(carbohydrateantigen242,CA242),糖類抗原125(carbohydrate

3、 antigen125,CA125),糖類抗原15-3(carbohydrate antigen153,CA15-3),甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP),鐵蛋白(Ferritin,Fer),游離型前列腺特異性抗原(free prostate specific antigen,F-PSA),前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA),生長激素(human growth hormon

4、e,HGH)及絨毛膜促性腺激素β(β-HCG)等12種腫瘤標志物,涵蓋了大約10種常見的惡性腫瘤,適用于健康人群的體檢、篩查及進行腫瘤的輔助診斷。但在具體應用過程中發(fā)現(xiàn)C-12蛋白芯片具有診斷靈敏度低、特異度低、分析困難、無法準確定位等缺點,限制其臨床的進一步應用。
　　 發(fā)展高靈敏的免疫分析技術對于腫瘤標志物的檢測有著至關重要的意義。電化學免疫傳感器利用抗原和抗體間的高度特異性結合,將免疫分析法和電化學傳感器相結合,該傳感器具

5、有靈敏度高,分析速度快,操作簡便、價格低廉及選擇性好等優(yōu)點,被廣泛應用于臨床診斷領域。納米生物技術是納米技術與生物技術交叉滲透形成的新技術,是生物醫(yī)學領域的一個重要發(fā)展方向。納米粒子具有優(yōu)良的電學、磁學、光學性質以及優(yōu)越的生物相容性,可用于固定抗體,在免疫分析中已得到廣泛的應用?，F(xiàn)今,免疫分析法和免疫傳感器的研制成為檢測腫瘤標志物的研究新興技術。大量研究用于研發(fā)操作簡便易行的傳感器。盡管這個領域的技術具有不少優(yōu)點,但是尋求一種更加簡便,

6、靈敏度更高,選擇性更好的免疫方法仍然是現(xiàn)代醫(yī)學檢驗和生物醫(yī)學研究領域的研究熱點。
　　 本研究用C-12蛋白芯片法檢測2177例惡性腫瘤患者(肺癌836例,肝癌318例,胰腺癌84例,胃癌123例,腸癌338例,乳腺癌206例,卵巢癌47例,子宮內膜癌28例,食管癌197例)和2111例正常及良性疾病的非腫瘤患者的12項常見腫瘤標志物,并結合臨床資料進行回顧性研究。進而應用Bayes法建立腫瘤判別診斷函數(shù),提高C-12蛋白芯片對

7、腫瘤診斷的準確率并探討多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)對惡性腫瘤診斷的臨床意義。采用HTA、結合Vbscript及Javascript語言編程,研制《多蛋白芯片腫瘤判別》軟件。同時將納米技術、生物傳感技術和電化學分析技術結合用于免疫分析。應用納米二氧化硅顆粒、納米金包裹石墨烯納米復合物、PB-SiO2納米復合物和包裹了抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)的脂質體等納米材料,采用不同方法構建功能化生物分子固定界面,制備了一系列高靈敏的電化學免疫傳感

8、器。研究目的
　　 1.探討多腫瘤標志物在10種常見腫瘤中的表達及其臨床意義。
　　 2.通過Bayes法建立多腫瘤標志物判別函數(shù),以明確腫瘤類型,提高腫瘤診斷準確率,比較多腫瘤標志物判別函數(shù)與C-12多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)的差異和對腫瘤診斷的臨床意義。進而研制基于多腫瘤蛋白芯片檢測結果的腫瘤判別工具軟件系統(tǒng)。
　　 3.將IgG抗體標記到辣根過氧化物酶(HRP)摻雜二氧化硅納米顆粒表面(anti-IgG-

9、SiO2-HRP),建立一種簡單又靈敏的電化學免疫分析方法檢測人血清中IgG的水平。
　　 4.制備納米金包裹的石墨烯納米復合物(NGGN)標記二抗,基于夾心免疫分析模式,建立一種新型高靈敏電化學免疫免疫傳感器,用于檢測血清中癌胚抗原(CEA)含量。
　　 5.使用PB-SiO2復合納米粒子,殼聚糖-金納米粒子復合物(CS-nanoAu)制備檢測小細胞肺癌的性能優(yōu)良的新型電化學免疫傳感器。
　　 6.采用分別包裹

10、了抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)的脂質體作為信號放大的載體,構建了一種可同時檢測小細胞肺癌血清標志物ProGRP和NSE的生物傳感技術。
　　 研究內容和方法
　　 1.多腫瘤標志物在惡性腫瘤中的表達及其臨床意義
　　 用蛋白芯片法檢測2177例惡性腫瘤患者(肺癌836例,肝癌318例,胰腺癌84例,胃癌123例,腸癌338例,乳腺癌206例,卵巢癌47例,子宮內膜癌28例,食管癌197例)和2111例正常及患良

11、性疾病的非腫瘤患者的12項常見腫瘤標志物,并結合臨床資料進行回顧性研究。建立腫瘤蛋白芯片數(shù)據(jù)庫和臨床數(shù)據(jù)庫。進而分析各腫瘤標志物在常見十種腫瘤中的表達及其臨床意義。
　　 2.多腫瘤標志物判別函數(shù)的建立及診斷軟件的研制
　　 應用Bayes法建立腫瘤判別診斷函數(shù),比較12種腫瘤標志物和判別診斷函數(shù)對腫瘤診斷的準確率差異。并采用HTA、結合Vbscript及Javascript語言編程。
　　 3.雙重標記納米二氧

12、化硅顆粒電化學免疫傳感器檢測血清中IgG
　　 合成HRP摻雜納米二氧化硅,然后將IgG抗體鍵合到納米二氧化硅的表面,制得anti-IgG-SiO2-HRP并作為檢測抗體,使用央心免疫分析方法,在酶底物過氧化氫存在的條件下,免疫反應前后電流的變化與抗原的濃度成正比。
　　 4.新型納米金包裹石墨烯納米復合物檢測癌胚抗原高靈敏電化學免疫傳感器的研究。
　　 電沉積普魯士藍修飾玻碳電極,并在其表面電沉積一層納米金,固

13、載癌胚抗體蛋白。制備辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)的二抗標記的NGGN顆粒,利用夾心免疫分析方法實現(xiàn)對癌胚抗原的高靈敏檢測。
　　 5.基于PB-SiO2納米復合物的信號增強的免標記電化學免疫傳感器用于檢測神經化烯醇酶(NSE)
　　 利用層層自組裝技術將PB-SiO2復合納米粒子,殼聚糖-金納米粒子復合物(CS-nanoAu)依次組裝到玻碳電極表面形成具有高表面能和良好氧化還原活性的夾心結構納米復合膜。
　　 6

14、.基于脂質體信號增強的電化學免疫傳感器同時檢測血清中ProGRP和NSE
　　 采用分別包裹了抗壞血酸和尿酸的脂質體作為信號放大的載體,利用免疫反應的高特異性,結合電化學的高靈敏性,構建了一種可同時檢測ProGRP和NSE的生物傳感技術。
　　 研究結果
　　 1.多腫瘤標志物在惡性腫瘤中的表達及其臨床意義
　　 2.多腫瘤標志物判別函數(shù)的建立及診斷軟件的研制
　　 3.雙重標記納米二氧化硅顆粒電

15、化學免疫傳感器檢測血清中IgG
　　 4.新型納米金包裹石墨烯納米復合物檢測癌胚抗原高靈敏電化學免疫傳感器的研究
　　 5.基于PB-SiO2納米復合物的信號增強的免標記電化學免疫傳感器用于檢測神經化烯醇酶
　　 6.基于脂質體信號增強的電化學免疫傳感器同時檢測血清中ProGRP和NSE
　　 結論
　　 1.多腫瘤標志物在惡性腫瘤中的表達及其臨床意義
　　 C-12蛋白芯片在腫瘤普查、診

16、斷、判斷預后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實用價值。但其具有診斷靈敏度低、特異度低,分析困難,無法準確定位等缺點,限制其臨床的進一步應用。
　　 2.多腫瘤標志物判別函數(shù)的建立及診斷軟件的研制
　　 Bayes法建立多腫瘤標志物判別函數(shù)具有較高靈敏度、特異度和準確率,對腫瘤的診斷具有重要臨床價值。研制的軟件自動完成腫瘤診斷判別方程計算,為腫瘤臨床醫(yī)師提供了一種科學、便捷、高效的工具。
　　 3.雙

17、重標記納米二氧化硅顆粒電化學免疫傳感器檢測血清中IgG
　　 成功研制一種靈敏度高、制備簡單的電化學免疫傳感器,通過使用HRP摻雜的二氧化硅作為標記,使用夾心免疫分析模式,實現(xiàn)對人體血清中IgG的檢測。該方法的優(yōu)點就在于使用了雙重標記納米顆粒作為檢測抗體,改善了夾心免疫分析方法,提高了該免疫分析的靈敏度。
　　 4.新型納米金包裹石墨烯納米復合物檢測癌胚抗原高靈敏電化學免疫傳感器的研究。
　　 成功研制了一種新型

18、的高靈敏的導電的納米標記物用于構建電化學免疫傳感器,該免疫傳感器可用于對痕量血清中CEA的檢測,為臨床腫瘤的診斷提供了一個新的方法。
　　 5.基于PB-SiO2納米復合物的信號增強的免標記電化學免疫傳感器用于檢測神經化烯醇酶(NSE)
　　 成功構建了檢測NSE電化學傳感器免疫傳感器,具有靈敏度高、響應時間快、線性范圍寬等特點,實現(xiàn)了微量NSE的定量檢測,表明該傳感器在NSE的診斷方面具有一定的應用前景。