SD大鼠牙乳頭與微孔濾膜結(jié)合誘導(dǎo)牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)再生的研究.pdf

1、牙乳頭（dental papillae）由未分化間充質(zhì)細(xì)胞組成，是牙胚發(fā)育過程中的一過性組織，密集分布于成釉器下方，是成牙本質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的來源組織，對牙本質(zhì)形成發(fā)揮主要作用。原發(fā)性牙本質(zhì)（primary dentine）是牙齒發(fā)育完成之前形成的牙本質(zhì)，它的形成受到上皮與牙源性間充質(zhì)相互作用的控制，這種調(diào)節(jié)是通過基底膜（basement membrane,BM）介導(dǎo)的?；啄な怯梢粚犹厥獾谋∑瑺罴?xì)胞外基質(zhì)（extracellular mat

2、rix,ECM）構(gòu)成，位于上皮與牙源性間充質(zhì)之間，作為一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)參與了多種細(xì)胞分化和功能構(gòu)建。
　　基底膜是誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化與促進(jìn)牙本質(zhì)形成的天然支架。它是牙源性上皮組織的誘導(dǎo)下由間充質(zhì)和上皮共同形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但在成體情況下,上皮來源的組織隨著牙齒的發(fā)育成熟逐漸萎縮消失。因此，找到一種能夠仿照上皮發(fā)揮誘導(dǎo)作用的途徑對于基底膜的形成和牙本質(zhì)的再生就顯得十分關(guān)鍵。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合有牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP)或TGF-β的

3、微孔濾膜在狗的穿髓模型中能夠誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和形成牙本質(zhì)，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)對病損部位的防御。我們想到能否用類似的方法用于組織工程化牙本質(zhì)的研究呢？可以設(shè)想在牙本質(zhì)再生過程中找到一種膜性材料能夠部分發(fā)揮基底膜的功能，從而誘導(dǎo)形態(tài)規(guī)則的管狀牙本質(zhì)的形成，以達(dá)到預(yù)期的生成效果。為此我們設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：
　　1.牙乳頭組織與復(fù)合有TGF-β1微孔濾膜結(jié)合后誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)
　　取出生后4d仔鼠，處死后浸入75

4、％乙醇中15s。無菌條件下分離上下頜，體視顯微鏡下在PBS液中將頜骨骨板挑開，分離第一和第二磨牙牙胚，將磨牙胚外軟組織去凈后，機(jī)械分離成釉器和牙乳頭，將分離的牙乳頭組與復(fù)合有TGF-β的微孔濾膜相結(jié)合，放置于Millicell插入式培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。一周后取出培養(yǎng)物，4％多聚甲醛固定24小時(shí)，用于掃描電鏡觀察、HE和免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果表明牙乳頭組織細(xì)胞在濾膜表面貼附生長，細(xì)胞突起伸入濾膜孔徑中，與濾膜牢固結(jié)合；HE染色顯示牙乳頭組織與微

5、孔濾膜結(jié)合緊密，沿著微孔濾膜觀察到呈層狀排列的細(xì)胞，細(xì)胞高度大體一致，部分細(xì)胞呈極化狀態(tài)，垂直于濾膜表面。免疫熒光染色DSP及DMP-1可見貼附濾膜表面的細(xì)胞呈陽性。
　　2.牙乳頭組織與復(fù)合有TGF-β1微孔濾膜結(jié)合后誘導(dǎo)牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)再生體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　取出生后4d的仔鼠，處死后浸入75％乙醇中15s。無菌條件下分離上下頜，體視顯微鏡下在PBS液中將頜骨骨板挑開，分離第一和第二磨牙牙胚，將磨牙胚外軟組織去凈后，機(jī)械分離成釉器

6、和牙乳頭。體視顯微鏡下剪開牙乳頭，將準(zhǔn)備好的微孔濾膜置入，在DMEM中37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，制備好的重組體用于移植。將體重約300gSD大鼠暴露腎臟，將重組體植入腎被膜下。14天后取移植物檢測。結(jié)果可見層狀礦化物在微孔濾膜表面上方形成，厚度均勻一致，礦化物結(jié)構(gòu)致密。移植物HE染色可見大量礦化基質(zhì)沿微孔濾膜沉積，礦化物厚度較一致，在基質(zhì)表面有極化的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分布。DSP與DMP-1免疫熒光染色，提示在靠近礦化基質(zhì)的成牙本質(zhì)樣

7、細(xì)胞表達(dá)陽性，呈帶狀分布。
　　3.牙乳頭細(xì)胞團(tuán)與復(fù)合有TGF-β1微孔濾膜結(jié)合后誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)
　　取出生后4d仔鼠，分離出牙乳頭組織，將其剪成1mm3大小組織塊，消化培養(yǎng)原代牙乳頭細(xì)胞。鋪滿后傳代。待第二代細(xì)胞鋪至80～90％，消化離心成團(tuán)，移至準(zhǔn)備好的微孔濾膜上，一起放入含血清的DMEM中，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)7d。取出培養(yǎng)物，4％多聚甲醛固定48h，用于掃描電鏡觀察、HE及免疫組化染色。

8、結(jié)果顯示細(xì)胞團(tuán)在微孔濾膜上生長良好，一部分細(xì)胞突起深入濾膜的孔徑中，HE染色顯示細(xì)胞團(tuán)與微孔濾膜界限清晰，靠近微孔濾膜的細(xì)胞極化，垂直于濾膜排列，形態(tài)發(fā)生高柱狀變化。免疫熒光染色可見DSP和DMP-1在沿微孔濾膜分布的高柱狀分化細(xì)胞呈弱陽性表達(dá).
　　4.牙乳頭細(xì)胞團(tuán)與復(fù)合有TGF-β1微孔濾膜結(jié)合后誘導(dǎo)牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)再生體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　取出生后4d的仔鼠，分離出牙乳頭組織后，將牙乳頭組織剪成1mm3大小組織塊，消化培養(yǎng)原代牙乳

9、頭細(xì)胞。鋪滿后傳代。待第二代細(xì)胞鋪至80～90％，消化離心成團(tuán)，移至準(zhǔn)備好的微孔濾膜上，置于DMEM中37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，制備好的重組體被用于移植。將體重約300gSD大鼠暴露腎臟，將重組體植入腎被膜下。飼養(yǎng)14天后大鼠脫頸處死，取移植物用于檢測。結(jié)果顯示：大量礦化基質(zhì)沿微孔濾膜沉積，基質(zhì)厚度較一致，礦化部分呈現(xiàn)管狀牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。在基質(zhì)表面有排列整齊的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分布。DSP和DMP-1免疫熒光染色中靠近基質(zhì)的高柱狀細(xì)胞表