冷凍干燥牙本質(zhì)在牙髓-牙本質(zhì)復合體再生中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、齲齒、牙周病、創(chuàng)傷等,是引起牙齒缺失最常見的一類疾病?，F(xiàn)有牙齒缺失的治療方法主要是傳統(tǒng)義齒修復或種植體修復,但傳統(tǒng)義齒修復是一種被動的、需要余留組織補償?shù)男迯头绞?不能完全恢復咀嚼效率;而種植修復雖然能克服缺牙數(shù)目的限制,但由于其與牙槽骨的剛性連接缺乏牙周膜結(jié)構(gòu)的緩沖、感知功能及天然的細胞封閉作用,故存在感染或因牙合力過大導致骨吸收的風險,與天然牙齒相比仍有較大的差異。
　　牙缺失治療的研究熱點之一是利用組織工程再生牙組織?，F(xiàn)今牙

2、再生的瓶頸之一是缺乏理想的組織工程支架材料以提供種子細胞合適的生長環(huán)境。支架材料除了應(yīng)具有良好的機械性能、良好的生物相容性,還應(yīng)含有豐富的成牙相關(guān)生物活性因子以誘導種子細胞向成牙的方向分化,并應(yīng)易于保存和運輸。牙本質(zhì)來源廣泛,具有的特殊組織結(jié)構(gòu)可以促進種子細胞的成牙能力。牙本質(zhì)基質(zhì)成分十分復雜,包含成牙相關(guān)的所有蛋白和因子并具有潛在的免疫原性。冷凍干燥技術(shù)(簡稱凍干)能使物料在干燥的同時能夠保持自身的結(jié)構(gòu)、形狀和性質(zhì),很多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用

3、。本課題擬通過冷凍干燥技術(shù)對牙本質(zhì)進行處理,以降低牙本質(zhì)的免疫原性、保護其中的生物活性物質(zhì),方便牙本質(zhì)支架材料的保存和運輸,對制成的凍干牙本質(zhì)進行機械力學性能檢測,并通過體內(nèi)、外實驗對凍干牙本質(zhì)的生物相容性和誘導成牙能力進行評估,以期獲得適宜牙再生的凍干牙本質(zhì)生物支架材料。
　　第一部分冷凍干燥牙本質(zhì)(FDDM)的制作及材料性能檢測
　　研究目的：
　　1)制作冷凍干燥牙本質(zhì)生物支架材料
　　2)檢測FDDM的機

4、械力學性能及膠原釋放能力
　　研究方法：
　　1)在去除牙髓、牙周組織的基礎(chǔ)上,將經(jīng)深冷凍的牙本質(zhì)進行冷凍干燥處理,輻照滅菌,真空包裝保存。
　　2)通過壓實驗、三點彎曲實驗以及維氏顯微硬度實驗檢測凍干牙本質(zhì)的機械力學性能;ELISA法檢測材料的膠原釋放能力;通過掃面電鏡、HE染色觀察FDDM的組織結(jié)構(gòu)。
　　實驗結(jié)果：
　　1)得到的凍干牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)均一,在形狀、大小、色澤上沒有顯著變化。
　　2)凍

5、干牙本質(zhì)與普通牙本質(zhì)的抗壓強度沒有顯著性差異,但這兩個牙本質(zhì)組的抗壓強度與HA組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.01),抗壓強度遠高于HA;抗壓彈性模量、撓曲強度、撓曲彈性模量檢測結(jié)果顯示相同趨勢;FDDM的I型膠原(COL-1)釋放能力與普通牙本質(zhì)無統(tǒng)計學差異;FDDM的維氏顯微硬度略高于普通牙本質(zhì);凍干處理對牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響不顯著。
　　結(jié)論：
　　制作出的FDDM與普通牙本質(zhì)相比具有相似的組織結(jié)構(gòu)、機械力學強度、COL-1

6、釋放能力及略高的表面硬度。
　　第二部分冷凍干燥牙本質(zhì)生物相容性檢測及對DPSCs的影響。
　　研究目的：
　　1)體外分離培養(yǎng)并鑒定DPSCs的生物學特性
　　2)體外檢測凍干牙本質(zhì)(FDDM)的生物相容性及對牙髓干細胞(DPSCs)的影響
　　研究方法：
　　1)對從人牙髓組織中分離出的DPSCs進行克隆形成能力、多向分化能力及間充質(zhì)干細胞表面標志物的流式細胞檢測。
　　2)對FDDM表面的

7、DPSCs進行細胞增殖;細胞周期;膠原分泌;ALP活性檢測;Real-time PCR檢測FDDM表面DPSCs成牙、成骨及相關(guān)細胞外基質(zhì)分泌基因表達;細胞免疫熒光染色檢測相關(guān)蛋白表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1)分離培養(yǎng)出的DPSCs具有克隆形成能力和多向分化潛能;流式細胞儀檢測細胞特定抗原表達顯示:STRO-1,CD29,CD90,CD105及CD44表達呈陽性,而造血干細胞表面標志CD34、CD45以及內(nèi)皮細胞表面標志C

8、D31表達呈陰性。結(jié)果符合牙髓間充質(zhì)干細胞的表面標志物表達。
　　2)凍干牙本質(zhì)同普通牙本質(zhì)一樣,對牙髓干細胞具有良好的生物相容性,在細胞形態(tài)、細胞活性、膠原分泌及成牙、細胞外基質(zhì)分泌的相關(guān)基因、蛋白表達上均優(yōu)于羥基磷灰石-磷酸三鈣,但ALP活性及骨向分化相關(guān)的基因、蛋白表達均低于羥基磷灰石-磷酸三鈣。
　　結(jié)論：
　　1)成功分離培養(yǎng)出DPSCs。
　　2) FDDM具有良好的生物相容性,與HA相比,能夠促進D

9、PSCs的活性及細胞外基質(zhì)的分泌,促進DPSCs的牙向分化。但降低DPSCs的骨向分化能力。
　　第三部分利用冷凍干燥牙本質(zhì)進行牙髓牙本質(zhì)復合體再生的體內(nèi)實驗研究。
　　研究目的：
　　1)體內(nèi)驗證凍干牙本質(zhì)(FDDM)的生物相容性和誘導DPSCs再生牙髓-牙本質(zhì)樣復合體的能力
　　研究方法：
　　將DPSCs細胞膜片聚集體分別與FDDM、普通牙本質(zhì)(D)和HA復合后進行裸鼠皮下移植,每只裸鼠背部皮下植入一

10、枚牙髓干細胞膜片-支架復合體,SPF級別飼養(yǎng)8周后進行HE染色、馬氏三色染色及相關(guān)蛋白的免疫組化染色。
　　實驗結(jié)果：
　　凍干牙本質(zhì)/普通牙本質(zhì)-牙髓干細胞復合物再生出牙髓-牙本質(zhì)樣組織,極性的成牙本質(zhì)樣細胞沿著新生成的前期牙本質(zhì)整齊排列,且沒有觀察到炎癥反應(yīng)。羥基磷灰石-磷酸三鈣-牙髓干細胞復合物中沒有觀察到典型的牙髓-牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成,可見炎性細胞浸潤。免疫組化染色顯示普通牙本質(zhì)與凍干牙本質(zhì)陽性表達ALP、COL-3、