海洋褐藻多糖藥物的微量分析方法研究.pdf

1、褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)組成的線性嵌段化合物?？剐难芩幬镌逅犭p酯鈉(PSS)、降脂抗栓藥物甘糖酯(PMS)、抗尿路結(jié)石藥物古糖酯(PGS)三者分別是以褐藻膠、聚甘露糖醛酸(Ploymannuronic acid，PM)和聚古羅糖醛酸(Polyguluronic acid，PG)為主要原料經(jīng)分子修飾制備的硫酸多糖藥物。由于M和G為C5差向異構(gòu)體，使得這三種海洋褐藻多糖藥物在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面都十分相似

2、，目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很難將三者加以準(zhǔn)確區(qū)分，而且三種藥物目前缺乏一種快速簡(jiǎn)便的適合于生物體內(nèi)及體外檢測(cè)的方法，特別是微量的研究方法。本論文基于PSS、PMS和PGS三種海洋褐藻多糖藥物的糖醛酸組成不同，建立了適合于三種藥物微量分析的柱前衍生高效液相色譜方法和高效脈沖積分安培陰離子色譜分析方法。 本論文以褐藻膠為原料，采用酸降解和乙醇.丙酮沉淀后剩余上清濃縮后得到了M和G的單糖混合品(MG)，建立了采用凝膠滲透排阻色譜法和離子交換色譜

3、法制備M和G單糖標(biāo)準(zhǔn)品的分離條件，并獲得了具有較高純度的M和G單糖標(biāo)準(zhǔn)品。在對(duì)PSS、PMS和PGS三種海洋褐藻多糖藥物采用三氟乙酸(TFA)進(jìn)行降解的基礎(chǔ)上，與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生化反應(yīng)，建立了適合于三種藥物糖醛酸組成微量分析的柱前衍生高效液相色譜方法(PMP-HPLC)。采用四因素三水平正交試驗(yàn)確定了采用TFA降解三種海洋褐藻多糖的最佳條件為：PSS、PMS、PGS的最適降解條件為降解溫度110℃，降解

4、時(shí)間6h，TFA濃度3 mol/L；確定了與PMP反應(yīng)的最適衍生條件為反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間90 min，PMP與供試品的摩爾比為12:1，NaOH與供試品的摩爾比為2:1；色譜條件為：0.1 mol/L磷酸鹽(pH6.7)緩沖液一乙腈(V/V，82:18)，檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm，流速：1mL/min。在此色譜條件下，M和G具有良好的分離度，測(cè)得PSS、PMS、PGS的M/G分別為2.37±0.05、6.60±0.22和0.22±0.

5、03，樣品的加標(biāo)回收率約為97.6％～101.2％，檢測(cè)限為5.2×10-3 nmol(1.01ng)。該方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性，靈敏度高，適合于海洋褐藻多糖類(lèi)藥物的微量分析。 本論文采用CarboPac PA20離子交換柱，以Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，建立了三種藥物采用TFA降解后，不經(jīng)衍生化處理直接應(yīng)用于糖醛酸組成微量分析的高效脈沖安培陰離子色譜分析方法(HPAEC-PAD)。結(jié)果表明：PSS、PMS、

6、PGS的最適降解條件為降解溫度115℃，降解時(shí)間4h，TFA濃度3 mol/L；最佳色譜條件為：流動(dòng)相：100 mmol/L NaAc/20 mmol/L NaOH，流速：0.4mL/min，柱溫：20℃在此色譜條件下，M和G具有良好的分離，測(cè)得PSS、PMS、PGS的M/G分別為2.06±0.06、6.21±0.08和0.04±0.05，樣品的加標(biāo)回收率為90.1％～98.0％，檢測(cè)限為6.4×10-3nmol(1.25ng)。該方法