負(fù)載IGF-1及BMP-2的新型組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究通過IGF-1及BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs促使其向軟骨細(xì)胞分化，采用Ⅰ型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，對(duì)存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染將IGF-1轉(zhuǎn)入ADSCs，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后以腺病毒為載體BMP-2基因序貫轉(zhuǎn)染ADSCs，雙基因聯(lián)合誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞方向分化，通過Ⅱ型膠原、MMP-3等指標(biāo)測(cè)定來判斷是否穩(wěn)定表達(dá)，以期為開

2、展IGF-1及BMP-2基因聯(lián)合治療軟骨缺損的研究奠定基礎(chǔ)。 研究材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料：新西蘭大白兔，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)活性觀察。 (1)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法，分離、純化兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 (2)向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)。GM-1及β-巰基乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)向神經(jīng)元

3、樣細(xì)胞分化。 (3)生物學(xué)性狀的觀察。用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并拍照。繪制P2代ADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。同時(shí)對(duì)比體外P1、P13代ADSCs的細(xì)胞周期構(gòu)成。 2、IGF-1及BMP-2雙基因序貫轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究。 (1)真核表達(dá)質(zhì)粒peDNA3.1+IGF-1的擴(kuò)增純化及鑒定。 (2)重組真核腺病毒表達(dá)載體Ad-BMP-2的擴(kuò)增純化及鑒定。 (3)建立穩(wěn)

4、定表達(dá)peDNA3.1+IGF.1-ADSCs細(xì)胞株，RT-PCR及Western blot檢測(cè)IGF-1表達(dá)。 (4)重組腺病毒表達(dá)載體Ad-BMP-2序貫轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)peDNA3.1+IGF.1-ADSCs細(xì)胞株。RT-PCR檢測(cè)BMP-2的表達(dá)。 (5)相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并1％甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨結(jié)節(jié)。 (6)繪制單基因及雙基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖曲線。 (7)Western blot及免疫熒光

5、檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。 (8)Western blot檢測(cè)MMP-3表達(dá)。 (9)透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 3、以殼聚糖與明膠為原料制備成的生物支架復(fù)合負(fù)載有IGF-1及BMP-2基因的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建三維組織工程軟骨。 (1)以殼聚糖與明膠為原材料通過冷凍干燥真空致孔法制備生物復(fù)合支架。 (2)將細(xì)胞與復(fù)合支架復(fù)合后聯(lián)合培養(yǎng)。 (3)掃描電鏡觀察細(xì)胞、支架的復(fù)合情況。 研究

6、結(jié)果： 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)成功。 (1)Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織后所分離得到的細(xì)胞大多為圓形單個(gè)核細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)后原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。各代細(xì)胞形態(tài)基本一致，都為長(zhǎng)梭形。 (2)經(jīng)GM-1及β-巰基乙醇誘導(dǎo)組細(xì)胞NSE表達(dá)陽性。 (3)繪制P2代ADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，通過分析可以看出ADSCs的增殖符合干細(xì)胞增殖規(guī)律，其增殖速度較快。 2、通過IGF-1及BMP-2雙

7、基因聯(lián)合誘導(dǎo)，ADSCs成功誘導(dǎo)分化成軟骨樣細(xì)胞。 (1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+IGF-1擴(kuò)增純化成功。 (2)重組真核腺病毒表達(dá)載體Ad-BMP-2的擴(kuò)增純化成功。 (3)成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADSCs真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+IGF-1。 (4)IGF-1、BMP-2基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞出現(xiàn)軟骨結(jié)節(jié)。 (5)單基因IGF-1及雙基因IGF-1和BMP-2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞仍具有較高的增殖能力。

8、(6)雙基因轉(zhuǎn)染IGF-1及BMP-2后細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原，且表達(dá)量較單純穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1的表達(dá)量增高。 (7)雙基因轉(zhuǎn)染IGF-1及BMP-2后的ADSCs其MMP-3的表達(dá)較單純穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1的ADSCs及未轉(zhuǎn)染的ADSCs均有不同程度的降低。 (8)雙基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)提示細(xì)胞合成代謝旺盛，細(xì)胞功能活躍。 3、以殼聚糖與明膠為原料制備成的生物支架復(fù)合負(fù)載有IGF-1及BNP-2的脂肪間充質(zhì)

9、干細(xì)胞構(gòu)建三維組織工程軟骨。 (1)以殼聚糖與明膠為原材料通過冷凍干燥真空致孔法成功制備成的生物復(fù)合支架，孔隙豐富利于細(xì)胞帖附。 (2)該支架與誘導(dǎo)后細(xì)胞復(fù)合佳，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。 研究結(jié)論： 1．、通過I型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法在體外能夠成功培養(yǎng)出增殖能力強(qiáng)的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，可以作為組織工程的種子細(xì)胞。 2、通過IGF-1及BMP-2的雙基因序貫轉(zhuǎn)染ADSCs成功誘導(dǎo)成軟骨樣細(xì)胞。