乳腺癌三維缺氧模型的構(gòu)建及EMT機制的初步探討.pdf

1、目的:
　　1.利用層層自組裝(LBL)技術(shù)制備較為理想的明膠-海藻酸鈉-殼聚糖多層納米膜，并與人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231共培養(yǎng)，檢測其表征。應(yīng)用3D體外培養(yǎng)體系簡單模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的缺氧微環(huán)境，為進一步研究缺氧條件下EMT機制對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用提供更優(yōu)越的平臺。
　　2.選用裸鼠為實驗對象，比較傳統(tǒng)二維培養(yǎng)條件和三維腫瘤模型下乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤以及遷移情況，初步探討三維培養(yǎng)模型相比于二維培養(yǎng)模型的優(yōu)勢，

2、為進一步開展對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲性轉(zhuǎn)移的研究提供一定的理論與實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.購買人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，常規(guī)復(fù)蘇后用含10％FBS、100U/ml的青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3d傳代，傳代的細(xì)胞分成兩組，一組用于傳統(tǒng)二維培養(yǎng)，一組與自組裝納米膜混合共培養(yǎng)，構(gòu)建3D腫瘤組織模型。
　　

3、2.從南方醫(yī)科大學(xué)購買BALB/c-nu裸鼠，精心飼養(yǎng)，觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動能力等。所有的動物實驗都遵守南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心指定的動物相關(guān)制度。
　　3.3D腫瘤組織模型的構(gòu)建。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞以1×106/cm2接種密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液待細(xì)胞融合至80％-90％后用PBS洗兩遍，用含0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化，于鏡下觀察消化情

4、況，待70％細(xì)胞變圓脫下時，用完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打瓶底細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，800rmp，5min，離心去上清液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)在1×107。收集到的細(xì)胞均勻分散到已經(jīng)預(yù)熱的1％明膠溶液中(7ml)，細(xì)胞材料作用十分鐘后，1000rmp，5min，離心去除多余的明膠溶液，此時細(xì)胞表面沉積一層陽離子型聚電解質(zhì)薄膜。然后將預(yù)熱的0.1％海藻酸鈉溶液(7ml)與聚電解質(zhì)薄膜反應(yīng)10分鐘，1000rmp，5min，離心去除多余的海藻酸鈉溶液，

5、得到表面是陰離子的聚電解質(zhì)薄膜。上述兩個步驟重復(fù)三次，最后可得到包裹有大量乳腺癌細(xì)胞的聚陰離子多層納米膜。將0.2％殼聚糖溶液(7ml)與等體積RPMI-1640培養(yǎng)基充分混合，pH值調(diào)至6.7左右，與聚陰離子多層納米膜反應(yīng)10分鐘，1000rmp，5min，離心去除多余的殼聚糖溶液，從而形成聚陽離子納米膜。培養(yǎng)基輕輕重懸納米膜，后置于六孔板中，37℃、5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。培養(yǎng)一天后，將納米膜轉(zhuǎn)移至另一個孔繼續(xù)培養(yǎng)

6、。正常二維培養(yǎng)細(xì)胞作為對照。取出復(fù)合MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的聚電解質(zhì)納米膜，PBS清洗三次，予活死染色試劑盒觀察納米膜上細(xì)胞的存活狀況。2.5％戊二醛固定后，掃描電鏡和透射電鏡分別觀察納米膜表面以及內(nèi)部的細(xì)胞生長狀況。4％多聚甲醛常溫固定后冰凍切片做活死染色檢測納米膜內(nèi)部細(xì)胞的活性，免疫熒光檢測納米膜上腫瘤細(xì)胞HIF的表達情況。
　　4.將培養(yǎng)四天的二維培養(yǎng)的細(xì)胞(cells in2D culture)以及從納米膜上遷移出

7、的細(xì)胞（cells migrated from3D culture）用含0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化后，收集細(xì)胞懸液，分別加入等體積的PBS液和Matrigel膠重懸，充分混勻，用1ml注射器抽取100ul（細(xì)胞總數(shù):5×106），左手拇指食指固定裸鼠頭部，無名指及小指固定尾巴，右手將細(xì)胞懸液注射于裸鼠右裸鼠右脅助部皮下，分別得到移植有二維培養(yǎng)細(xì)胞的裸鼠（2D組，5只）和移植有納米膜上遷出細(xì)胞的裸鼠（3Dm，5只）。納

8、米膜經(jīng)PBS洗3次，切開裸鼠右側(cè)胸壁皮膚約1.0cm，暴露脂肪墊，將腫瘤球移植入皮下間隙，縫合切口，得到移植有3D腫瘤球的裸鼠（3Di，5只）。每天觀察其存活情況、精神活動狀態(tài)、稱體重。每天觀察其成瘤狀況。腫瘤長出后，隔天觀察腫瘤形態(tài)，測量裸鼠腫瘤的長徑和長徑垂直的短徑，計算其體積并繪制腫瘤生長曲線。50天后，處死裸鼠，稱重腫瘤組織。
　　5.裸鼠腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的檢測。離斷頸髓法將裸鼠處死，剝離裸鼠腫瘤組織，保留其包膜，將

9、其置于4％多聚甲醛中固定約24h，冰凍切片后予N-cadherin、E-cadherin蛋白免疫熒光檢測。
　　6.統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件完成，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示。兩獨立樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗分析，采用Equalityof Variances方法（方差齊）或者Satterthwaite近似t檢驗方法（方差不齊），p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較采用單因素方差分析(One-way AN

10、OVA)，方差齊性的組間比較采用Tukey法，方差不齊的組間比較采用Dunnett's T3法，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.通過LBL法構(gòu)建的多層納米膜結(jié)構(gòu)呈白色透明狀，表面含有大量的細(xì)胞，生物相容性好，隨著培養(yǎng)時間延長，腫瘤細(xì)胞不斷從納米膜中爬出。
　　2.掃描電鏡結(jié)果顯示:由納米膜所形成的多細(xì)胞腫瘤球呈多孔性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，網(wǎng)間隙較小，這有利于水分，營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣滲透;腫瘤球表面細(xì)胞生長

11、良好，細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用，形成腫瘤細(xì)胞生長的3D立體環(huán)境，組織表面的腫瘤細(xì)胞比較理想的粘附在3D材料支架上。
　　3.納米膜表面的活死染色結(jié)果顯示腫瘤球表面可見少量死亡細(xì)胞（紅色），腫瘤球呈三維立體結(jié)構(gòu)，生物相容性好。
　　4.納米膜冰凍切片后的活死染色結(jié)果可見腫瘤球表面活細(xì)胞較多（綠色），而腫瘤球內(nèi)部則見到大量的死細(xì)胞（紅色）。免疫熒光檢測HIF蛋白表達(568nm激發(fā)紅光)，CD47蛋白大量表達（4

12、88nm激發(fā)綠光），DAPI染核（藍(lán)色），可見大量細(xì)胞核碎片，邊緣不清晰，細(xì)胞發(fā)生凋亡。正常二維培養(yǎng)組細(xì)胞未見HIF表達，DAPI染核（藍(lán)色）清晰。透射電鏡結(jié)果顯示腫瘤球內(nèi)部細(xì)胞出現(xiàn)壞死，脂滴形成。
　　5.2D組、3Dm組、3Di組接種腫瘤后第10天，2D組和3Dm組5只裸鼠腋下均出現(xiàn)腫瘤，體積分別為277.86±50.00mm3，72.97±88mm3。2D組和3Dm組腫瘤體積隨著時間不斷的增長，2D組裸鼠的腫瘤體積明顯大于3

13、Dm組裸鼠腫瘤體積，且腫瘤的增長速度快于3Dm組腫瘤。在腫瘤接種后第21天，2D組裸鼠腫瘤體積為1685.87±258.09mm3，3Dm組裸鼠腫瘤體積為486.33±373.98mm3，3Dm組與2D組腫瘤體積有顯著性差異(p＜0.05)。腫瘤移植后第29天，2D組裸鼠腫瘤體積為2160.62±17.19mm3，3Dm組裸鼠腫瘤體積為695.90±525.75mm3，3Dm組腫瘤體積明顯較2D組腫瘤體積小，且有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01

14、)。接種后第40天，2D組裸鼠腫瘤體積為3561.47±617.42mm3，3Dm組裸鼠腫瘤體積為939.15±706.74mm3，3Dm組腫瘤體積明顯小于2D組腫瘤體積，且有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。接種后26天，3Di組5只裸鼠腋下出現(xiàn)腫瘤，腫瘤很小，不易測量，且生長緩慢。2D組裸鼠腫瘤體積生長速度快，腫瘤出現(xiàn)8天后，裸鼠腫瘤表面出現(xiàn)潰瘍壞死。3Dm組有一只裸鼠出現(xiàn)潰瘍，而3Di組裸鼠腫瘤表面均未出現(xiàn)潰瘍。接種后50天，2D組其中

15、一只裸鼠死亡，實驗終止。
　　6.接種腫瘤后，三組裸鼠精神狀態(tài)及活動能力一直很好，未見明顯活動異常。2D組裸鼠腫瘤體積后期增長迅速，狀態(tài)逐漸衰弱。在腫瘤接種50天時，2D組其中一直裸鼠出現(xiàn)死亡，實驗終止。取材后，2D組、3Dm裸鼠三只裸鼠均形成具有完整包膜的腫瘤組織，腫瘤重量分別為0.456±0.052g、0.102±0.822g。3Di組裸鼠有一只形成具有完整包膜的腫瘤組織，腫瘤重量為0.031±0.010g。3Dm組和3Di組

16、腫瘤腫瘤無顯著差異(p＞0.05)，3Dm組相對于2D組有顯著差異(p＜0.05)，同時3Di組裸鼠腫瘤重量也顯著小于2D組(p＜0.01)。此外，3Di組另外兩只裸鼠皮下出現(xiàn)腫瘤樣白色組織，未形成完整包膜。
　　7.免疫熒光檢測2D組、3Dm組、3Di組腫瘤組織N-cadherin蛋白(568nm激發(fā)綠光)和E-cadherin蛋白（488nm激發(fā)綠光）表達情況，結(jié)果示:2D組N-cadherin蛋白表達強陽性（紅色），DAPI

17、染核（藍(lán)色），細(xì)胞異型性明顯，可見細(xì)胞核碎片，核多呈空泡狀。3Dm組E-cadherin蛋白強陽性（綠色），DAPI染核（藍(lán)色）清晰;3Di組腫瘤組織N-cadherin蛋白陽性（紅色），E-cadherin蛋白陽性（綠色），DAPI染核（藍(lán)色）未見異常;3Di組腫瘤樣白色組織E-cadherin蛋白大量表達（綠色），DAPI染核（藍(lán)色）清晰。
　　結(jié)論:
　　1.基于明膠-海藻酸鈉-殼聚糖自組裝制備的3D體外腫瘤模型具有良

18、好的生物相容性，再現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，為細(xì)胞的生長提供了一個和體內(nèi)近乎相似的三維立體的空間結(jié)構(gòu)，并且其可簡單模擬體內(nèi)實體腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀況，更加接近體內(nèi)完整的腫瘤組織。
　　2.在動物水平，3D腫瘤模型不僅模擬了缺氧介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促發(fā)的腫瘤侵襲能力增強的過程，而且其所構(gòu)建的休眠微環(huán)境限制了細(xì)胞的迅速遷移，起到了休眠屏障的作用，模擬了腫瘤生長所必經(jīng)的潛伏期階段，真實再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤生長的過程，這也更