高血糖促心臟連接蛋白43磷酸化及其對連接通道功能的影響.pdf

1、心臟間隙連接通道是心肌細(xì)胞之間的特殊連接通道,其功能是完成心肌細(xì)胞之間的電化學(xué)信息交換,其功能的異常與心律失常的發(fā)生有密切關(guān)系。心室間隙連接通道主要由連接蛋白43組成。間隙連接通道的功能主要受胞內(nèi)pH值、胞內(nèi)Ca2+濃度、連接蛋白磷酸化狀態(tài)、跨通道電壓的調(diào)控。新近的一些研究表明高血糖可以促間隙連接通道連接蛋白43磷酸化并使其功能發(fā)生改變。但高血糖促連接蛋白43磷酸化的具體位點(diǎn)及其機(jī)理尚不清楚。高血糖可以激活蛋白激酶C,而蛋白激酶C又可以

2、使連接蛋白43羧基末端絲氨酸磷酸化,據(jù)此推測高血糖可能通過使連接蛋白43羧基末端絲氨酸磷酸化而改變其調(diào)控功能。由此,本課題組擬應(yīng)用基因點(diǎn)突變、抗原再現(xiàn)技術(shù)來研究高血糖對間隙連接通道連接蛋白43的促磷酸化作用及其機(jī)制,如果能闡明高血糖致心臟間隙連接通道功能異常的機(jī)制,那將有助于闡明糖尿病患者心律失常的發(fā)生機(jī)理并為預(yù)防及治療糖尿病并發(fā)心律失常開辟另一嶄新的方向。
　　本研究首先通過構(gòu)建pcDNA3-野生型連接蛋白43質(zhì)粒(Wt-Cx4

3、3-pcDNA3)、pcDNA3-突變型連接蛋白43質(zhì)粒(S262F-Cx43-pcDNA3,S368A-Cx43-pcDNA3),分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng) G418篩選后得到表達(dá)相應(yīng)連接蛋白43的細(xì)胞株( Wt-Cx43-HeLa細(xì)胞, S262F-Cx43-HeLa細(xì)胞,S368A-Cx43-HeLa細(xì)胞)。應(yīng)用上述細(xì)胞株分兩部分進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。第一部分是在篩選后細(xì)胞株的培養(yǎng)基中加入不同濃度的葡萄糖(5mmol/L,25mmol/L

4、),應(yīng)用抗磷酸化Cx43特異性抗體或應(yīng)用Cx43位點(diǎn)磷酸化抗體通過細(xì)胞免疫化學(xué),細(xì)胞免疫熒光,及免疫印跡分析Cx43磷酸化情況。對比分析不同葡萄糖濃度對Cx43磷酸化的影響及磷酸化位點(diǎn)。第二部分通過應(yīng)用 Lucifer Yellow劃痕試驗(yàn)檢測高血糖間隙連接通道功能的改變。
　　結(jié)果表明:1,高血糖能促使Cx43磷酸化;2,應(yīng)用抗連接蛋白43磷酸化特異性位點(diǎn)的抗體( p-connexin43-Ser368和p-connexin43

5、-Ser262)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光, Western bloting,結(jié)果表明高血糖促使連接蛋白43的Ser368位點(diǎn)磷酸化,而對Ser262的無磷酸化作用;3,應(yīng)用Lucifer Yellow劃痕試驗(yàn)檢測間隙連接通道功能的改變,結(jié)果表明高血糖能降低間隙連接通道傳導(dǎo)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究表明(1)高血糖可以促進(jìn)Cx43的磷酸化,提高Cx43的磷酸化程度;(2)高血糖促使連接蛋白43的Ser368位點(diǎn)磷酸化;(3)高血糖能降低間隙連接通道傳