DARPP-32基因在胰腺癌中的表達(dá)及t-DARPP蛋白對(duì)病毒殺傷腫瘤效應(yīng)的影響.pdf

1、目的：惡性實(shí)體腫瘤治療是臨床醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)性課題,由于腫瘤轉(zhuǎn)移,使手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療方法對(duì)晚期腫瘤的療效有限,所以需要具有創(chuàng)新性的腫瘤治療方法。而且新的方法應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞有更好的選擇性,同時(shí)又不會(huì)與現(xiàn)有常用的治療方法相拮抗。復(fù)制選擇性溶腫瘤腺病毒(Replication-selective oncolytic Adenovirus,RSOA)是腫瘤治療領(lǐng)域中一種新的具有廣闊應(yīng)用前景的治療方法。這種病毒通過基因改造后,可以選擇性的在

2、腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺傷細(xì)胞,而在正常細(xì)胞中不復(fù)制或復(fù)制很低。與常規(guī)化放療相結(jié)合已顯示其明顯的安全性和有效性,而單獨(dú)使用RSOA療效甚微。腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因特有的改變及其與腺病毒相互作用的分子信號(hào)傳導(dǎo)通路是影響RSOA抗腫瘤效果的關(guān)鍵因素。通過一系列腫瘤細(xì)胞對(duì)復(fù)制選擇性溶腫瘤腺病毒敏感性的篩選,發(fā)現(xiàn)DARPP-32在病毒殺傷敏感和不敏感細(xì)胞中的表達(dá)有差異,推測其可能影響病毒殺傷腫瘤。DARPP-32(Dopamine and cAMP-regu

3、lated phosphoprotein)是多巴胺和環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)的磷蛋白。DARPP-32有兩種形式的表達(dá)產(chǎn)物:DARPP-32和t-DARPP,均定位于細(xì)胞質(zhì),屬于磷酸酯酶抑制劑1家族。DARPP-32是參與神經(jīng)元慢突觸傳導(dǎo)及調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物分子磷酸化狀態(tài)的核心蛋白,是唯一具有PKA和PP1(蛋白磷酸酶1)雙重抑制作用的分子。t-DARPP與DARPP-32相比,只缺少第34位蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),不具有PP1抑制作用,但仍具有PKA

4、抑制作用。近期研究發(fā)現(xiàn)DARPP-32和t-DARPP在胃癌細(xì)胞中有持續(xù)的高表達(dá),其作用和機(jī)制不明。本研究的目的是檢測DARPP-32在人胰腺癌中表達(dá)情況,利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染,Westernblot(Western免疫印跡)和病毒殺傷實(shí)驗(yàn)等研究t-DARPP蛋白是否影響病毒殺傷腫瘤效應(yīng)。該研究實(shí)驗(yàn)中所用的病毒是復(fù)制溶腫瘤腺病毒。
　　方法：1.免疫組織化學(xué)檢測,觀察DARPP-32在人胰腺癌中的表達(dá)情況。2.雙酶切(HindⅢ,EcoR

5、Ⅰ)和基因測序鑒定pcDNA3.1(+)-t-DARPP重組質(zhì)粒。t-DARPP基因的長度為525bp。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法):將構(gòu)建成功的含有t-DARPP的pcDNA3.1(+)表達(dá)載體導(dǎo)入不含此基因的胰腺癌細(xì)胞系(PATU8988T)使其表達(dá)t-DARPP蛋白。4.RT-PCR檢測細(xì)胞目的基因mRNA的表達(dá)。引物如下:t-DARPP-32引物片段全長289bp5′TGCGCTGGCTCAGTCTCCTT3′5′GGCCTGG

6、TTCTCATTCAAATTGCT3′5.Western blot在蛋白水平上檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功。6.病毒殺傷實(shí)驗(yàn):利用CCK-8法比較復(fù)制溶腫瘤病毒對(duì)含有和不含t-DARPP蛋白的胰腺癌細(xì)胞系(PATU8988T)的殺傷力有無差別。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,線性趨勢性檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析。
　　結(jié)果：1.免疫組織化學(xué)結(jié)果分析:DARPP-32基因在人胰腺癌中的表達(dá)率為30％。2.t-DARPP基因

7、正確插入pcDNA3.1(+)載體中。3.RT-PCR檢測到長度為289bp的目的片段。4.Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-t-DARPP重組質(zhì)粒后的PaTu8988T細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)t-DARPP蛋白。5.t-DARPP蛋白可以增強(qiáng)復(fù)制溶腫瘤腺病毒殺傷胰腺癌細(xì)胞系PaTu8988T的敏感性。
　　結(jié)論：1.DARPP-32基因在人胰腺癌中的表達(dá)率為30％。2.t-DARPP蛋白影響病毒殺傷腫瘤細(xì)胞,可