銀杏葉提取物EGb761抗谷氨酸興奮毒性作用與Snk-SPAR途徑的相關(guān)性研究.pdf

1、谷氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性過程被認(rèn)為與中風(fēng)、癲癇、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化等重大神經(jīng)系統(tǒng)疾患的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而離子型谷氨酸受體——N-甲基-D-門冬氨酸受體 (N-methyl-D-asparate receptor，NMDAR)在此過程中起最主要的作用。人們試圖通過干預(yù)谷氨酸興奮毒性損傷過程中的不同環(huán)節(jié)來實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)與損傷修復(fù)的目的，但結(jié)果均不盡人意。抗興奮毒性研究急需找到新的靶點。在這種情況下，一個可望產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)與神經(jīng)發(fā)生調(diào)控雙重效

2、應(yīng)的新的重要靶點便是血清誘導(dǎo)激酶(serum-inducible kinase，Snk)-樹突棘相關(guān)的Rap特異性GTPase活化蛋白 (spine-asSOCiated Rap guanosine triphosphatase (GTPase)activating protein，sPAR)途徑對興奮性突觸傳遞中樹突棘的調(diào)控。興奮性谷氨酸能突觸的突觸后結(jié)構(gòu)約有90﹪位于樹突棘上，樹突棘構(gòu)成了哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的原始位點

3、，是學(xué)習(xí)和記憶活動的生物學(xué)基礎(chǔ)。SPAR位于樹突棘的突觸后致密區(qū)(postsynaptic density，PSD)中，與NMDAR與腳手架蛋白PSD-95組成復(fù)合體，是調(diào)節(jié)活動依賴性突觸重構(gòu)的重要蛋白之一，并與樹突棘的成熟及形態(tài)的維持密切相關(guān)。近來發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元活化時，被誘導(dǎo)產(chǎn)生的Snk可以使SPAR蛋白磷酸化和降解，最終導(dǎo)致樹突棘結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)定。因此，Snk-SPAR信號途徑可能會通過調(diào)控樹突棘的穩(wěn)定性在一定或較大程度上參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)

4、興奮毒性損傷過程，然而目前我們對此領(lǐng)域還一無所知。 銀杏葉提取物是一種含有黃酮類和萜內(nèi)酯等多種活性成分的混合物，具有抗氧化和清除自由基、抑制由缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制和消除β淀粉樣蛋白(β-amyloid)的聚積、影響神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運等功能，臨床上已廣泛應(yīng)用于治療中風(fēng)、記憶力減退、癡呆以及其他動脈閉塞性疾病，但其相關(guān)的作用機(jī)制卻仍未完全闡明。 本課題的目的在于觀察谷氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元興奮毒性損傷與Snk-SPAR途徑

5、之間的關(guān)系，并研究興奮毒性過程中銀杏葉提取物EGb761對Snk-SPAR途徑的干預(yù)及其對樹突棘形態(tài)的調(diào)節(jié)作用，不僅探討了銀杏葉提取物抗興奮毒性神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，更可望為神經(jīng)保護(hù)/神經(jīng)發(fā)生調(diào)控提供新的策略和手段。 方法： 對體外培養(yǎng)18d的原代大鼠海馬神經(jīng)元給予終濃度100μM谷氨酸和10μM甘氨酸，采用臺盼藍(lán)染色、熒光TUNEL及LDH檢測方法，觀察谷氨酸對神經(jīng)元的損傷情況。在谷氨酸誘導(dǎo)興奮毒性損傷模型中，通過R

6、T-PCR方法檢測．Snk/SPA尺在mRNA水平的表達(dá)變化，蛋白質(zhì)免疫印跡方法觀察Snk/SPAR在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。用EGb761和MK-801預(yù)處理海馬神經(jīng)元，通過臺盼藍(lán)染色、熒光TUNEL和LDH檢測法觀察EGb761 和MK-801 對海馬神經(jīng)元興奮毒性損傷的保護(hù)效應(yīng)，并通過RT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、熒光原位雜交和雙重?zé)晒鈽?biāo)記的方法，分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平觀察EGb761 和MK-801 預(yù)處理對谷氨酸刺激后所誘導(dǎo)

7、的海馬神經(jīng)元中Snk/SPAR的表達(dá)水平及分布變化的影響。通過海馬神經(jīng)元綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法觀察EGb761和MK-801預(yù)處理對谷氨酸興奮毒性模型中神經(jīng)元樹突棘損傷的保護(hù)作用。 結(jié)果： 一．谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元興奮毒性損傷中Snk/SPAR表達(dá)水平的變化(一)體外培養(yǎng)18d的原代大鼠海馬神經(jīng)元加入100μM谷氨酸和10μM甘氨酸處理10min，18h后檢測神經(jīng)元死亡率為35﹪，凋亡率為37.2﹪，損傷程度是

8、正常組的3.1倍。 (二)神經(jīng)元基礎(chǔ)狀態(tài)下 Snk mRNA水平較低，經(jīng)100μM 谷氨酸和10μM甘氨酸處理10min后，1h即可出現(xiàn)表達(dá)水平升高，6h達(dá)高峰，約為基礎(chǔ)水平的4.2倍，隨后逐漸下降，12h左右回到基線水平。而基礎(chǔ)狀態(tài)下 SPAR mRNA水平較高，當(dāng)谷氨酸刺激后，隨著Snk mRNA表達(dá)水平的增高而表達(dá)減少，到6h達(dá)到最低，約為基礎(chǔ)水平的34﹪，此后逐漸恢復(fù)。 (三)在蛋白質(zhì)水平，Snk在正常神經(jīng)元中很難被檢測

9、到，而SPAR表達(dá)豐富。谷氨酸刺激后3h，Snk的表達(dá)開始緩慢增強(qiáng)，一直持續(xù)到36h達(dá)最高峰，約是基礎(chǔ)水平的3.3倍，此后開始下降；與mRNA水平一致，谷氨酸刺激后，SPAR的變化趨勢與Snk相反，但變化的幅度大于前者，至谷氨酸刺激后36h已基本檢測不到。 二.銀杏葉提取物EGb761抗谷氨酸興奮毒性作用中Snk-SPAR途徑機(jī)制探討(一)在谷氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮毒性損傷中，EGb761與MK-801預(yù)處理均有神經(jīng)元保護(hù)作用。

10、EGb761和MK-801預(yù)處理組神經(jīng)元與谷氨酸組神經(jīng)元相比，死亡率分別降低了31.4﹪和67.8﹪，凋亡率分別降低了37.8﹪和68.2﹪，LDH漏出量分別降低了32.6﹪和60.6﹪。 (二)谷氨酸刺激后6h，EGb761與MK-801預(yù)處理組同谷氨酸組相比，Snk mRNA水平分別下降了約39﹪和46﹪，而SPAR mRNA水平上升了約47﹪和65﹪。 (三)谷氨酸刺激后36h，EGb761和MK-801預(yù)處理組的

11、Snk水平比谷氨酸組分別降低了48.7﹪和52.5﹪，而SPAR水平也分別上升到了正常組的66.1﹪和72.4﹪。 (四)EGb761與MK-801預(yù)處理可以對谷氨酸誘導(dǎo)興奮毒性過程中神經(jīng)元突起上Snk分布增多及其所導(dǎo)致的SPAR分布減少有明顯的阻斷作用。 (五)谷氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性作用對海馬神經(jīng)元的樹突棘結(jié)構(gòu)有明顯的損傷作用，表現(xiàn)為樹突棘的退化消失、樹突干的靜脈曲張樣改變等，樹突棘的數(shù)量比正常組減少了約70.5﹪，而E

12、Gb761與MK-801預(yù)處理可以明顯改善谷氨酸對樹突棘的損傷情況，與谷氨酸組相比，樹突棘的數(shù)量分別增長了56.7﹪和60.6﹪。 結(jié)論： 一.谷氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性損傷可以導(dǎo)致Snk/SPAR在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，提示谷氨酸興奮毒性過程與Snk-SPAR途徑密切相關(guān)。 二.EGb761預(yù)處理給藥有顯著的抗谷氨酸興奮毒性作用，但此作用不如MK-801明顯。 三．在谷氨酸興奮毒性過程中，無論在mR

13、NA水平還是蛋白質(zhì)水平，EGb761 預(yù)處理給藥可以明顯干預(yù)Snk/SPAR表達(dá)水平的變化，并對谷氨酸刺激所導(dǎo)致的Snk/SPAR的在神經(jīng)元上的分布變化有顯著影響，提示EGb76 l抗興奮毒性作用機(jī)制與調(diào)節(jié)Snk-SPAR途徑的信號傳遞有關(guān)。 四．谷氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性作用對海馬神經(jīng)元的樹突棘結(jié)構(gòu)有明顯的損傷作用，可能與激活Snk-SPAR途徑有關(guān)。 五．EGb761 預(yù)處理可以明顯改善谷氨酸對樹突棘的損傷情況，其維持樹突