序貫調(diào)控hVEGFAng-l歷、基因表達(dá)對(duì)缺血心肌血管生成的影響.pdf

1、目的:建立兔心肌梗死動(dòng)物模型,在此模型的基礎(chǔ)上,以2型重組腺相關(guān)病毒(rAAV2)為載體,將9HRE(低氧反應(yīng)元件)調(diào)控的hVEGF165(人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)及Tet-on-Advanced調(diào)控的Ang-1(血管生成素-1)轉(zhuǎn)染兔梗死心肌,通過特定時(shí)間點(diǎn)體外主動(dòng)給予強(qiáng)力霉素(Doxcycline,Dox),觀察兩系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)染hVEGF165與Ang-1基因表達(dá)的調(diào)控作用,并進(jìn)一步檢測(cè)序貫調(diào)控hVEGF165與Ang-1基因表達(dá)后對(duì)缺血心

2、肌的生血管作用。
　　 方法:成年日本大耳白兔,于冠狀動(dòng)脈左前降支中下1/3交界處結(jié)扎造成心肌缺血。采用心肌直接注射方法將目的基因轉(zhuǎn)染缺血心肌。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為8組:A組(雙基因序貫調(diào)控組):同時(shí)轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA-Rs-M2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液(混合比例為4:1:4),基因轉(zhuǎn)染6w后靜脈給予DOX誘導(dǎo)基因序貫表達(dá)。B組(雙基因非序貫調(diào)控組):同時(shí)轉(zhuǎn)染rAAV-9

3、HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA-Rs-M2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液(混合比例為4:1:4),術(shù)后立即靜脈給DOX誘導(dǎo)基因同時(shí)表達(dá)。C組(單純hVEGF165組):單獨(dú)轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165。D組(單純Ang-1組):單獨(dú)轉(zhuǎn)染rAAV-rtTA-Rs-M2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1(混合比例為1:4),術(shù)后立即靜脈給DOX誘導(dǎo)基因表達(dá)。E組(溶劑對(duì)照組):梗死區(qū)域注射

4、等量無菌生理鹽水,不予DOX誘導(dǎo)。F組(載體對(duì)照組)同時(shí)轉(zhuǎn)染rAAV-TRE-Tight-luciferase、rAAV-rtTA-Rs-M2和rAAV-9HRE-LacZ混合液(混合比例為4:1:4),基因轉(zhuǎn)染后處理同A組。G組(假手術(shù)組)開胸在左前降支中下1/3交界處穿線但不結(jié)扎,不予DOX誘導(dǎo)。H組(正常對(duì)照組)未開胸正常兔。
　　 通過術(shù)中觀察、心電圖描記、HE染色和Masson三色染色驗(yàn)證梗死模型建立成功。采用West

5、ern blot方法檢測(cè)hVEGF165和Ang-1基因的表達(dá)情況。通過免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)各組新生血管數(shù)量和成熟度。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支中下1/3交界處的方法建立了兔心肌梗死模型,術(shù)中觀察缺血心肌局部顏色變紫,心電圖描記術(shù)后ST段弓背向上抬高,HE染色顯示,缺血梗死區(qū)的心肌細(xì)胞排列不齊,肌細(xì)胞數(shù)量減少,心肌細(xì)胞溶解后空泡形成,纖維化,梗死區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson三色染色示,梗

6、死區(qū)有大面積藍(lán)色片狀膠原纖維形成。
　　 2.Western blot結(jié)果顯示,A組與E組梗死區(qū)心肌組織均可檢測(cè)到hVEGF165蛋白表達(dá),梗死形成初期表達(dá)即開始增加,6w時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰,此后表達(dá)量逐漸下降。與E組相比,A組在8,10,12w蛋白表達(dá)量明顯增加。同樣,兩組心肌組織均可檢測(cè)到Ang-1蛋白表達(dá),0,2,4,6w表達(dá)量極低,8,10,12w表達(dá)量增加。在8,10,12w與E組比較,A組Ang-1蛋白表達(dá)量明顯增加。

7、
　　 3.免疫組化結(jié)果顯示,A組和各對(duì)照組梗死區(qū)心肌組織均可見新生血管生成,與B組(0.21±0.05)、D組(0.19±0.06)、E組(0.15±0.05)及F組(0.15±0.05)比較,A組新生血管面積比例(0.26±0.05)顯著增加。但與C組(0.33±0.09)、G組(0.31±0.04)及H組(0.31±0.06)比較,A組新生血管面積比例減少。
　　 4.免疫熒光結(jié)果顯示,與B組(18.20±5.51

8、)、C組(14.88±4.79)、D組(16.44±3.63)、E照(10.04±3.19)及F組(9.92±3.08)比較,A組新生小動(dòng)脈密度(26.08±4.03)明顯增加,但與G組(31.64±7.06)及H組(32.00±7.07)相比,A組新生小動(dòng)脈數(shù)量顯著減少。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示,與B組(0.12±0.02)、C組(0.06±0.01)、D組(0.11±0.01)、E組(0.09±0.02)及F組(0.09±0.03)比較