雷奈酸鍶促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨質(zhì)疏松是一種病理性現(xiàn)象，骨質(zhì)疏松癥是一種退化性疾病。隨著人類壽命的延長(zhǎng)，社會(huì)老齡化傾向越來越重，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為了嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的公共健康問題。有研究顯示，2006年全國年齡在50歲以上的人群中，約有6944萬人患有骨質(zhì)疏松癥，約2億1千萬人存在低骨量。骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重后果是造成骨折，其治療和護(hù)理需要大量的人力、物力和財(cái)力，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及心理負(fù)擔(dān)。所幸骨質(zhì)疏松癥是可防可治的，其藥

2、物預(yù)防和治療的主要目的是:緩解骨痛，提高骨量和骨質(zhì)量，降低骨折發(fā)生率。目前用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物大部分是基于抑制骨吸收或者是促進(jìn)骨形成的作用機(jī)制，減少過度的骨代謝，維持正常的骨量與骨質(zhì)量。不過近年來隨著對(duì)骨質(zhì)疏松癥病因、發(fā)病機(jī)制及對(duì)骨代謝分子生物學(xué)的深入研究，防治骨質(zhì)疏松癥的藥物研究也有了很大進(jìn)展。
　　 鍶(strontium)是人體必需的微量元素之一，參與人體內(nèi)很多生理功能和生化效應(yīng)。人工合成的鍶鹽雷奈酸鍶(stronti

3、um ranelate,Sr)是由法國Servier公司研制開發(fā)的一類新型抗骨質(zhì)疏松藥物，2004年11月在愛爾蘭首次上市，2009年在中國上市，在我國被國家食品藥品監(jiān)督局(State Food and Drug Administration，SFDA)批準(zhǔn)的適應(yīng)癥為治療和預(yù)防絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥以降低椎體和髖部骨折的危險(xiǎn)性。該藥由2個(gè)穩(wěn)定的非放射性鍶原子以及有機(jī)部分雷奈酸組成，這一特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)骨組織表現(xiàn)出相反的作用，即促進(jìn)骨的形成并

4、抑制骨的吸收，從而有利于骨質(zhì)形成。它是新一代抗骨質(zhì)疏松藥物，代表了在骨質(zhì)疏松癥治療史上一個(gè)新的發(fā)展方向，是第一種被稱為具有雙重治療作用——促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的新藥。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)能夠保持其干細(xì)胞的表型而引起多向分化，定向誘導(dǎo)其向成骨分化可為研究骨組織工程、骨折修復(fù)和骨質(zhì)疏松等難題提供理論基礎(chǔ)。隨著對(duì)鍶與骨代謝關(guān)系的深入研究，有學(xué)者報(bào)道鍶可促進(jìn)小鼠BMSCs和人B

5、MSCs向成骨細(xì)胞分化，能增加細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性、Ⅰ型膠原(Collagen TypeⅠ，COL-1)、骨鈣素(osteocalcin)等成骨細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)，同時(shí)也能促進(jìn)細(xì)胞的鈣化，但是其具體的作用機(jī)制尚不明確，其中關(guān)于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)以及鈣感應(yīng)受體(calciumsensing receptor, Ca

6、SR)等分子學(xué)機(jī)制已有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是一組具有類似高度保守結(jié)構(gòu)的功能強(qiáng)大的糖蛋白，除BMP-1(bone morphogenetic protein-1，BMP-1)屬于金屬肽鏈內(nèi)切酶家族(the astacin family of metallo endopeptidases)外，其余均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming grow

7、th factor-β，TGF-β)超家族。迄今為止，在人類胚胎發(fā)生、骨骼形成、造血生成及神經(jīng)發(fā)育過程中，已經(jīng)鑒定出骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族超過20種的具有各種不同作用的成員。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)已經(jīng)成為BMPs家族里被研究最廣的成員，其功能主要是從骨折愈合、骨質(zhì)缺損以及一些脊柱融合模型中分析得出。在人類和動(dòng)物的體外模型中，已經(jīng)證實(shí)BMPs可以刺激干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，其中B

8、MP-2是現(xiàn)在被研究最多的一種。但在BMSCs分化為成骨細(xì)胞的過程中，若加上Sr這一種刺激因素時(shí)，是否存在著BMP-2的作用還未見報(bào)道。為此，本研究觀察了Sr對(duì)BMSCs分化為成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用，研究了其對(duì)相關(guān)成骨標(biāo)記物的最佳作用濃度及最佳作用時(shí)間，最重要的是，本實(shí)驗(yàn)初步研究了在Sr刺激大鼠BMSCs分化為成骨細(xì)胞的過程中，BMP-2表達(dá)的變化及其所起的作用，為探討Sr可能的促成骨機(jī)制提供新穎的實(shí)驗(yàn)資料。
　　 研究方法:

9、>　　 一、大鼠BMSCs的獲取
　　 取4周齡雄性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死后用75％酒精浸泡5min，在無菌條件下分離出兩側(cè)股骨及脛骨，剔除表面的肌肉、筋膜等組織，剪去股骨近端和脛骨遠(yuǎn)端，暴露骨髓腔，用含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM低糖完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞，1000 r/min離心5min，棄上清，加入2ml上述DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，種植于培養(yǎng)瓶中并吹打混勻，標(biāo)

10、記為原代Po，置于37℃、5％CO2、80％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換新鮮培養(yǎng)液以去除未貼壁細(xì)胞和各種雜質(zhì)，加入5ml新鮮培養(yǎng)液。此后每隔2-3d換液一次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，直至細(xì)胞接近80％-90％融合時(shí)進(jìn)行傳代。此后每隔3-4d傳代一次。
　　 二、BMSCs的成骨分化
　　 選取第3-5代BMSCs為研究對(duì)象，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入成骨誘導(dǎo)液（含10％胎牛血清、

11、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml抗壞血酸的DMEM低糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)。
　　 三、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性檢測(cè)
　　 選取第3代細(xì)胞，以約1×105/ml的密度接種于24孔板，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素，于第7d采用酶標(biāo)法檢測(cè)ALP活性。檢測(cè)時(shí)將細(xì)胞收集后以0.2％TritonX-100裂解液

12、及反復(fù)凍融法充分裂解，裂解后用PBS洗2遍，12000 r/min離心10min，取上清液按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀520nm波長(zhǎng)處測(cè)定結(jié)果。
　　 四、茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色
　　 選取第3代細(xì)胞，接種于24mm×24mm蓋玻片上，蓋玻片預(yù)先置于六孔板中。各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素后，于第21天按照細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒說明書對(duì)樣本進(jìn)行固定、染色及澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況，每組取5個(gè)樣本，每樣本隨機(jī)取1

13、個(gè)視野(×100)，比較各組間的差異。
　　 五、real-time PCR法測(cè)定細(xì)胞分化中Runx2基因的表達(dá)
　　 取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為1×105/ml接種于25mm培養(yǎng)皿，每皿接種細(xì)胞懸液1mL，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞RNA進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)。
　　 六、Western blotting法檢測(cè)BMP-2蛋白表達(dá)水平
　　 選取第3代細(xì)胞，接種于60mm培養(yǎng)皿

14、中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗兩遍，加入細(xì)胞裂解液，4℃裂解30min，12000 r/min離心10min，取上清液，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5％脫脂奶粉封閉1.5h，隨后加入BMP-2抗體(1:1000)，4℃過夜，用TBST洗3次，每次10min，加入二抗(1:2500)孵育1.5h，再用TBST洗3次，每次10min。將膜用發(fā)光試劑ECL顯色

15、，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。
　　 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用單因素方差分析( One-way ANOVA)方法，方差齊性用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊用Dunnett’sT法進(jìn)行組間多重比較。P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 一、BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察
　　 原代MS

16、Cs接種時(shí)呈圓形，折光性強(qiáng)，與周圍混雜的大量血細(xì)胞辨識(shí)不清;原代培養(yǎng)24小時(shí)換液后去除一部分懸浮的血細(xì)胞，可見MSCs已貼壁生長(zhǎng)，部分呈圓形，部分已開始向周圍延伸，細(xì)胞形態(tài)呈三角形、多邊形、短小梭形等，折光性好;其后經(jīng)數(shù)次換液未貼壁細(xì)胞被基本清除干凈，可見貼壁細(xì)胞迅速增殖，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、成纖維樣，細(xì)胞排列具有一定的方向性，形成明顯集落。約7-10天細(xì)胞集落更加增多、擴(kuò)大，基本鋪滿瓶底，達(dá)80％以上融合，此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代;傳代后的

17、細(xì)胞形態(tài)更加單一，多呈較均一的長(zhǎng)梭形，分布均勻，融合成片的細(xì)胞呈漩渦狀、鋪路石樣排列，生長(zhǎng)較原代細(xì)胞更為迅速，約3-4天可基本鋪滿瓶底。
　　 二、Sr增加BMSCs的ALP活性
　　 在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，分別經(jīng)0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及7mmol/L Sr處理細(xì)胞7天，各組之間ALP活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=232.089,P=0.000)，各實(shí)

18、驗(yàn)組與對(duì)照組相比ALP活性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）;當(dāng)Sr濃度增加至3mmol/L時(shí)，ALP活性值與各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)，且均數(shù)最大，可認(rèn)為此時(shí)ALP活性增至最大。
　　 三、Sr促進(jìn)BMSCs的鈣結(jié)節(jié)生成
　　 經(jīng)3mmol/L Sr處理BMSCs21天，與對(duì)照組相比細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)生成增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.395,P=0.002)。
　　 四、Sr上調(diào)BMSC

19、s的Runx2表達(dá)
　　 BMSCs分別經(jīng)0mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L及10mmol/LSr處理7d，各組之間Runx2表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1120.869,P=0.000)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比Runx2表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。其中當(dāng)Sr濃度為1mmol/L時(shí)，與其余各實(shí)驗(yàn)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），且此時(shí)均數(shù)最大，可認(rèn)為此時(shí)Run

20、x2的表達(dá)水平達(dá)到最高值;經(jīng)1mmol/L Sr分別處理BMSCs0h、0.5h、1h、2h、4h、3d、7d及14d后，各組之間Runx2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( F=438.015,P=0.002)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01），當(dāng)處理時(shí)間為7d時(shí)，Runx2的表達(dá)均數(shù)最大，且與其余各實(shí)驗(yàn)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01），可認(rèn)為Runx2的表達(dá)水平達(dá)到最高峰。
　　 五、Sr上調(diào)BMSC

21、s的BMP-2表達(dá)
　　 BMSCs分別經(jīng)0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及7mmol/LSr處理7d后，各組之間BMP-2表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.117,P=.000)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)BMP-2表達(dá)均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;其中Sr濃度為1mmol/L時(shí)BMP-2表達(dá)水平的均數(shù)最大，與其余各實(shí)驗(yàn)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）

22、，可認(rèn)為此時(shí)BMP-2表達(dá)水平達(dá)到最高值;經(jīng)1mmol/LSr分別處理BMSCs0d、1d、3d、5d、7d及10d后，各組之間BMP-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.937,P=0.013)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)BMP-2表達(dá)均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）;其中處理時(shí)間為7d時(shí)BMP-2表達(dá)水平的均數(shù)最大，與其余各實(shí)驗(yàn)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），可認(rèn)為此時(shí)BMP-2表達(dá)水平達(dá)到最高值。
　　

23、 六、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對(duì)BMP-2表達(dá)的上調(diào)作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間BMP-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.384,P=0.000)。BMSCs經(jīng)1mmol/L Sr處理7d后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)BMP-2表達(dá)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）;在Sr處理BMSCs前，給予100ng/mlnoggin預(yù)處理2h后，細(xì)胞內(nèi)BMP-2表達(dá)較Sr組下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，no

24、ggin組及PBS組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.962、0.965）。
　　 七、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間ALP活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=906.400,P=0.000)。BMSCs經(jīng)3mmol/L Sr處理7d后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)ALP活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);在Sr處理細(xì)胞前，給予100ng/mlnoggi

25、n預(yù)處理2h后，細(xì)胞內(nèi)ALP活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，noggin組及PBS組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.060、0.527)。
　　 八、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對(duì)鈣結(jié)節(jié)生成的促進(jìn)作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間鈣結(jié)節(jié)數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.49,P=0.002)。BMSCs經(jīng)3mmol/L Sr處理21d后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)

26、學(xué)意義(P=0.002);在Sr處理細(xì)胞前，給予100ng/mlnoggin預(yù)處理2h后，細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000），noggin組及PBS組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.875、0.754)。
　　 九、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對(duì)Runx2表達(dá)的上調(diào)作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間Runx2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.196,P=0.000)。BMS

27、Cs經(jīng)1mmol/L Sr處理7d后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)，在Sr處理BMSCs前，給予100ng/ml noggin預(yù)處理2h后，細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，noggin組及PBS組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.738、1.000)。
　　 結(jié)論:
　　 一、Sr能夠促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞，表現(xiàn)為可增加BMSCs