子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子的生物信息學(xué)挖掘及S100P的作用和機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜接受胚胎著床的能力稱為子宮內(nèi)膜容受性。人類子宮內(nèi)膜只在月經(jīng)周期的20-24天具備接受胚胎植入的能力，稱為“子宮內(nèi)膜容受窗期”。在這一時(shí)期，子宮內(nèi)膜在下丘腦-垂體-卵巢軸的精確調(diào)控下發(fā)生了特殊的形態(tài)、生理和分子生物學(xué)的變化來(lái)易化胚胎植入。子宮內(nèi)膜容受性的建立是胚胎成功植入的決定因素，任何原因引起的子宮內(nèi)膜容受性不能建立或建立延遲，都會(huì)導(dǎo)致胚胎著床失敗。輔助生殖技術(shù)(ART)是解決人類不孕的重要手段，但試管嬰兒技術(shù)(IVF)發(fā)明至今

2、其成功率仍在20-30％徘徊。人們認(rèn)為子宮內(nèi)膜容受性缺陷大約占導(dǎo)致著床失敗原因的2/3，而胚胎原因僅占1/3，無(wú)法診斷和治療子宮內(nèi)膜容受性異常也是ART成功的主要障礙。因此，容受性的診斷和評(píng)估對(duì)提高輔助生殖技術(shù)的成功率具有極其重要的臨床意義。尋找子宮內(nèi)膜容受窗期特異性表達(dá)的標(biāo)志分子，闡明子宮內(nèi)膜容受性形成的分子機(jī)制，將極大地推動(dòng)生殖醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。
　　 隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，前期有許多研究應(yīng)用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)尋找子宮

3、內(nèi)膜容受性形成的標(biāo)志分子。然而，由于樣本量的限制、樣本來(lái)源的不同、數(shù)據(jù)本身的高維度及分析方法和分析標(biāo)準(zhǔn)的差異，這些高通量篩選得出的結(jié)果并不一致。目前，可靠的子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子仍然沒(méi)有找到，子宮內(nèi)膜容受性的分子機(jī)制仍不清楚。重復(fù)高通量篩選無(wú)疑是一件既費(fèi)錢(qián)又費(fèi)力的事，而前期大量高通量篩選堆積了大量數(shù)據(jù)并沒(méi)有得到充分利用。生物信息學(xué)的發(fā)展為我們有效利用前人的數(shù)據(jù)提供了平臺(tái)，不僅可以避免浪費(fèi)，而且從一定程度上擴(kuò)大了樣本量，增加了數(shù)據(jù)的可靠性

4、。本研究的第一部分應(yīng)用生物信息學(xué)的方法整合多中心數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘出在子宮內(nèi)膜容受窗期特異表達(dá)的分子作為標(biāo)志分子，并進(jìn)一步驗(yàn)證部分分子在著床窗口期的表達(dá)規(guī)律，為尋找容受性標(biāo)志分子及進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜容受形成的分子機(jī)制提供線索。
　　 胚胎著床過(guò)程包括胚胎在子宮內(nèi)膜上定位、粘附與侵入等環(huán)節(jié)，該過(guò)程涉及細(xì)胞的增生、凋亡、粘附、侵襲和血管增生等細(xì)胞學(xué)行為。S100P是本課題在前期生物信息學(xué)挖掘中發(fā)現(xiàn)的在容受窗期子宮內(nèi)膜特異性表達(dá)上調(diào)的

5、分子。已知該分子廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、及血管生成有關(guān)，然而該分子與子宮內(nèi)膜容受性形成的關(guān)系及在胚胎著床過(guò)程中的作用及機(jī)制目前還鮮有報(bào)道。本研究第二部分進(jìn)一步觀察S100P在子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律、P激素調(diào)節(jié)，并用RNA干擾和過(guò)表達(dá)技術(shù)探討S100P在子宮內(nèi)膜容受性建立中的作用及可能機(jī)制。本研究將有助于我們更好的理解胚胎植入伊始子宮內(nèi)膜容受性建立的分子機(jī)制。
　　 第一部分子宮內(nèi)膜容受性

6、標(biāo)志分子的生物信息學(xué)挖掘與分析
　　 目的：
　　 1、從現(xiàn)有的基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘子宮內(nèi)膜容受窗期特異表達(dá)的分子，為尋找子宮內(nèi)膜容受窗期標(biāo)志分子提供線索。
　　 2、運(yùn)用功能分析及相互作用網(wǎng)絡(luò)分析方法，分析這些差異表達(dá)基因的功能及其相互作用網(wǎng)絡(luò)，以進(jìn)一步了解子宮內(nèi)膜容受形成的分子機(jī)制。
　　 3、收集臨床標(biāo)本驗(yàn)證生物信息學(xué)挖掘的結(jié)果。
　　 材料與方法：
　　 1、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件Ge

7、neSifter從現(xiàn)有的基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘篩選在子宮內(nèi)膜容受窗期特異性表達(dá)的基因。
　　 2、用IPA軟件分析這些差異表達(dá)基因的功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)。
　　 3、收集育齡婦女不同時(shí)期子宮內(nèi)膜，用Realtime PCR驗(yàn)證這些差異表達(dá)基因在不同時(shí)期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)規(guī)律。
　　 結(jié)果：
　　 1、用生物信息學(xué)的方法整合已有的基因芯片數(shù)據(jù)，挖掘出子宮內(nèi)膜容受窗期差異表達(dá)大于2倍的基因1543個(gè)，大于5倍的基因

8、148個(gè)，大于10倍的基因31個(gè)。
　　 2、基因功能分析發(fā)現(xiàn)差異基因聚集最多的兩個(gè)功能類是免疫反應(yīng)和細(xì)胞周期。分子網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)高度差異表達(dá)的基因主要組成了兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)與心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能相關(guān)，另一個(gè)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其中TGFB1，TNF，ERBB2和FSH，CTNNB1，ESR1分別處于兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的中心，具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。
　　 3、我們選擇了9個(gè)基因(DKK1、S100P、FAM148A、MAOA、SFRP

9、4、CXCL14、CRISP3、ANXA4和SFN)用Realtime PCR進(jìn)行驗(yàn)證，所有基因表達(dá)與生物信息學(xué)軟件挖掘的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 用生物信息學(xué)的方法從已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘信息是一種可行的方法，不僅節(jié)約了資源，而且擴(kuò)大了樣本量，可以得到更加可靠的信息。
　　 第二部分 S100P在子宮內(nèi)膜容受性形成中的作用和機(jī)制研究
　　 目的：
　　 1、研究S100P在子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)中的時(shí)

10、序表達(dá)規(guī)律。
　　 2、觀察生殖激素對(duì)S100P表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 3、探討S100P對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞生理功能的影響。
　　 4、研究S100P影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生理變化的信號(hào)機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1、收集育齡婦女不同時(shí)期子宮內(nèi)膜和不同孕期婦女的胎盤(pán)組織，用RealtimePCR、Western blot和免疫熒光研究S100P的表達(dá)規(guī)律。并分離培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基

11、質(zhì)細(xì)胞，用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)S100P在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　 2、分離培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系RL952和Ishikawa，培養(yǎng)人胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞系Bewo。加入不同濃度雌二醇(E2)、孕酮(P4)并OHCG培養(yǎng)，設(shè)空白對(duì)照，培養(yǎng)24-72h，用Realtime PCR和In-cellWestern分析S100P表達(dá)的變化。
　　 3、體外培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞系RL952，應(yīng)

12、用慢病毒系統(tǒng)建立S100P干擾和/或過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，檢測(cè)S100P對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　 4、建立Bewo細(xì)胞球體與RL952和基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)體系模擬體外胚胎植入模型，觀察S100P對(duì)胚胎與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附及胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中侵襲的影響。
　　 5、鬼筆環(huán)肽染色觀察S100P對(duì)細(xì)胞骨架的影響；應(yīng)用免疫熒光和Realtime PCR檢測(cè)S100P對(duì)β-catenin信號(hào)通路和NFkB信號(hào)通

13、路分子的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、S100P在分泌中期子宮內(nèi)膜中特異性高表達(dá)，較另外三個(gè)時(shí)期高100多倍，在子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)中表達(dá)均增高。在妊娠期中，S100P在早孕絨毛和足月胎盤(pán)中高表達(dá)，而在早孕蛻膜和中孕胎盤(pán)中表達(dá)較低。細(xì)胞免疫熒光顯示S100P在胞漿和胞核中均有表達(dá)，其中以胞漿為主。
　　 2、與對(duì)照組相比，孕激素、雌孕激素聯(lián)合和HCG可以上調(diào)原代人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，及上皮細(xì)胞系Ishi

14、kawa中S100P的表達(dá)。在原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，S100P對(duì)雌、孕激素和HCG的反應(yīng)呈時(shí)間、劑量依賴性。
　　 3、在基質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)S100P后，S100P mRNA水平上調(diào)5倍以上，免疫熒光顯示蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)。在RL952和Ishikawa細(xì)胞中干擾S100P，干擾效率達(dá)98％以上。在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，S100P抑制了細(xì)胞的遷移，但促進(jìn)了細(xì)胞侵襲。S100P促進(jìn)了Bewo細(xì)胞球在基質(zhì)細(xì)胞中的擴(kuò)展。在RL952細(xì)

15、胞中，S100P干擾后，Bewo細(xì)胞球與RL952的粘附能力減弱。
　　 4、在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，S100P的表達(dá)變化與Ezrin的表達(dá)變化相反，干擾S100P促進(jìn)了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞膜的聚集。S100P抑制了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中β-catenin的核轉(zhuǎn)位，而促進(jìn)了NFkB的核轉(zhuǎn)位，并且上調(diào)了NFkB信號(hào)通路的激活分子IKKB的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、S100P在子宮內(nèi)膜容受窗期特異性高表達(dá)，參與了子

16、宮內(nèi)膜容受形成，可能在子宮內(nèi)膜容受性的形成中起著重要作用。
　　 2、在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100P的表達(dá)受到E、P和HCG的精確調(diào)控。
　　 3、S100P影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲，并且影響了胚胎在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上的粘附和在基質(zhì)細(xì)胞中的擴(kuò)展。
　　 4、S100P通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)、調(diào)節(jié)β-catenin和NFkB信號(hào)通路活性，影響了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與侵襲，進(jìn)而調(diào)節(jié)胚胎在子宮內(nèi)膜上的粘附與侵入。