FGD6基因?qū)Ω胃杉?xì)胞分化的調(diào)控作用_3724.pdf

1、目的：探討FGD6（faciogenital dysplasia）基因?qū)Ω胃杉?xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　方法：⑴選取FGD6基因的RNA干擾靶序列，將目的片段克隆到穿梭載體pSES-HUS上，再與骨架質(zhì)粒 pAdeasy-1共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，然后接種到卡那霉素平板中，挑選出陽(yáng)性克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒測(cè)序。⑵將測(cè)序證實(shí)正確的質(zhì)粒使用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒載體，包裝并擴(kuò)增重組腺病毒載體pSES-FGD6-siRNA。⑶使用細(xì)胞免疫熒

2、光法檢測(cè) FGD6蛋白在肝干細(xì)胞 HP14.5細(xì)胞中的表達(dá)水平及表達(dá)定位。⑷用腺病毒載體pSES-FGD6-siRNA感染HP14.5細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FGD6、甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（Alb）的mRNA水平，Western blot檢測(cè)FGD6、AFP及Alb的蛋白表達(dá)水平。每組細(xì)胞均設(shè)置pSES-Ad-RFP腺病毒空載體感染進(jìn)行對(duì)照。⑸所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用單因素方差分析的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分

3、析。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建腺病毒載體pSES-FGD6-siRNA，并完成病毒的擴(kuò)增及純化。②細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示 FGD6蛋白在肝干細(xì)胞HP14.5細(xì)胞中呈高表達(dá)，主要定位在細(xì)胞核中。③用腺病毒載體pSES-FGD6-siRNA感染HP14.5細(xì)胞，成功下調(diào)FGD6基因在HP14.5細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)，AFP的mRNA及蛋白的表達(dá)降低，而Alb的mRNA及蛋白的表達(dá)升高（P＜0.01）。
　　結(jié)論：抑制FGD6基因在肝