敬釗纓毛蛛毒素分子多樣性和功能研究.pdf

1、敬釗纓毛蛛是在我國海南島發(fā)現(xiàn)的一種有毒蜘蛛。它的毒液由許多具有不同生物活性物質(zhì)組成。為了更好地開發(fā)利用該生物資源，闡明敬釗纓毛蛛毒素分子多樣性及其遺傳進(jìn)化機(jī)制是非常重要的。我們?nèi)【瘁摾t毛蛛的毒腺建立cDNA文庫，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行測序，得到788個(gè)高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽。這些表達(dá)序列標(biāo)簽去冗余后，得到356個(gè)唯一序列，其中包括271個(gè)單拷貝序列和85個(gè)多拷貝重疊序列。這些唯一序列的31.4％是編碼分泌蛋白的，其中29.1％是富含半胱氨酸的

2、多肽，此類多肽稱之為胱氨酸結(jié)毒素（CKTs），以及2.3％的其他分泌蛋白序列；54.0％是與普通細(xì)胞蛋白相關(guān)的；還有14.6％的序列沒找到相似的已知序列。所有鑒定到的序列提交GenBank，序列接入號為：EU233831—EU233934和FE530957—FE531203。蜘蛛粗毒中的胱氨酸結(jié)毒素是作用于各種離子通道的新型配體。對104個(gè)胱氨酸結(jié)毒素前體進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，這些毒素可以分為6個(gè)家族，以及19個(gè)低相似性序列構(gòu)成的“孤兒

3、”家族。為了進(jìn)一步研究這些毒素家族的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化關(guān)系，我們分離純化到10個(gè)分別來自各家族的毒素，對其進(jìn)行電生理功能檢測、結(jié)構(gòu)建模比較、進(jìn)化分析和豐度分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些毒素家族分屬兩種類型：孔道堵塞毒素和門控調(diào)制毒素?？椎蓝氯舅卦诖侄局械暮勘容^多，在蜘蛛中分布較廣?？椎蓝氯亩舅刈饔冒悬c(diǎn)專一，而所作用的靶點(diǎn)在生物進(jìn)化中也較保守。因此，這類毒素是進(jìn)化中比較保守、產(chǎn)生比較早的一類。門控調(diào)制毒素所包含的分子種類很多，這是與通道多樣化

4、的調(diào)制位點(diǎn)共進(jìn)化的結(jié)果。對這些多肽毒素系統(tǒng)研究有可能為深入的藥理學(xué)應(yīng)用和研究提供大量的分子模板。另一方面，對普通細(xì)胞蛋白相關(guān)的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行的基因注釋揭示了一些新的可能的毒素成分和毒囊重要細(xì)胞生理過程的相關(guān)成分，比如蛋白翻譯后修飾，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，蛋白質(zhì)合成，能量供應(yīng)等等。敬釗纓毛蛛毒腺的轉(zhuǎn)錄組分析和基因的注釋編目展示了毒腺這個(gè)特化的產(chǎn)毒器官中的生理概況。 敬釗毒素—Ⅲ（JZTX—Ⅲ）是來自于敬釗纓毛蛛的一個(gè)通過電壓門控調(diào)制來抑制心肌鈉通

5、道的毒素。與β—蝎毒素不同的是，它使通道激活電壓朝去極化方向漂移約10mV，推測其結(jié)合位點(diǎn)可能為位點(diǎn)4。JZTX—Ⅲ展示了其對電壓門控心肌鈉通道亞型高親和力和高選擇性，使之有希望成為研究心肌鈉通道的有力工具。然而，該分子與鈉離子通道作用的活性表面還不得而知。為此，本課題中我們成功表達(dá)了JZTX—Ⅲ，表達(dá)的毒素與天然的毒素在分子、構(gòu)型和生理學(xué)活性上都一致。于是，對其進(jìn)行丙氨酸掃描，繼續(xù)表達(dá)JZTX—Ⅲ的20個(gè)單殘基由丙氨酸取代的突變體。其

6、中一個(gè)突變體未能表達(dá)成功。用膜片鉗實(shí)驗(yàn)——突變體在表達(dá)于HEK293細(xì)胞上的Nav1.5對電流的作用。實(shí)驗(yàn)表明，13個(gè)突變體對抑制Nav1.5電流的濃度依賴性的改變很小，有6個(gè)突變體對此影響較大，有一個(gè)甚至無法檢測到活性。突變體實(shí)驗(yàn)證明其活性表面是由疏水氨基酸和酸性氨基酸組成，而堿性氨基酸的突變對毒素抑制Nav1.5通道電流的活性影響不大。而且，當(dāng)13位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼釙r(shí)，其抑制Nav1.5的IC50值為31.9nM，其活性是野生型

7、JZTX—Ⅲ的十倍。在JZTX—Ⅲ的三維結(jié)構(gòu)圖上描出這些關(guān)鍵殘基，疏水性殘基在一個(gè)面上形成一個(gè)疏水面，兩個(gè)酸性殘基處于N端，在疏水面的相對面。從以上結(jié)果確定了JZTX—Ⅲ這個(gè)門控調(diào)制毒素專一作用于Nav1.5的分子活性表面，提示JZTX—Ⅲ在與心肌鈉通道結(jié)合時(shí)采取的是一種被稱為Voltage Sensor Trapping的模式，利用其疏水面結(jié)合于心肌鈉通道DomainⅡ區(qū)域，而其另一面的帶電荷殘基，特別是Asp1和Glu3利用電性引力