敬釗纓毛蛛毒素的異源表達(dá)及其電生理活性研究.pdf

1、敬釗蜘蛛（Chilobrachys jingzhao）是生長于我國南方的一種具有毒性的狼蛛，其毒液中成分十分復(fù)雜。目前已從敬釗狼蛛中分離純化出了超過60種毒素多肽。而敬釗毒素3（Jingzhaotoxin-III, JZTX-III）就是從此種狼蛛中分離純化得到的一種多肽類神經(jīng)毒素。JZTX-III由36個氨基酸殘基組成，并且含有3對二硫鍵。它能夠選擇性地作用于分布在心肌細(xì)胞膜上的人的鉀離子通道hKv2.1和人的鈉離子通道hNav1.5

2、，具有較高的研究價值。由于從天然蜘蛛毒液中分離得到JZTX-III的量很少，并且尚未通過原核表達(dá)的方法獲得此種毒素，我們將利用半乳糖自動誘導(dǎo)系統(tǒng)幫助E.coli SHuffle T7 Express菌種原核表達(dá)JZTX-III以提高其產(chǎn)量。通過優(yōu)化，我們得到最佳自動誘導(dǎo)條件為30℃、220rpm震蕩培養(yǎng)16h，并且在此條件下經(jīng)過鎳柱和RP-HPLC純化得到的rJZTX-III的產(chǎn)量高達(dá)12.1mg/L。質(zhì)譜結(jié)果顯示rJZTX-III具有

3、正確的分子量，說明表達(dá)成功。后期電生理實驗結(jié)果也表明rJZTX-III具有對hNav1.5的抑制活性。
　　為證明此表達(dá)系統(tǒng)具有一定的適用性，我們還利用半乳糖自動誘導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)rJZTX-46。JZTX-46是從敬釗狼蛛毒腺所構(gòu)建的DNA文庫中發(fā)現(xiàn)的一類功能未知的毒素，它由30個氨基酸殘基構(gòu)成并且含有3對二硫鍵。經(jīng)過質(zhì)譜檢測，表達(dá)純化得到的rJZTX-46的分子量與理論值吻合，說明rJZTX-46表達(dá)成功，也同時說明了半乳糖自動誘導(dǎo)

4、SHuffle菌種表達(dá)富含二硫鍵多肽的策略具有一定的適用性。由于JZTX-46與已知的JZTX-XII的同源性很高，我們參考JZTX-XII的特異性檢測了JZTX-46對hNav1.5和hNav1.7通道的活性，并發(fā)現(xiàn)無顯著作用。我們還將檢測其對鉀離子通道及其它通道的作用。
　　本文中我們還詳細(xì)描述了用于切割rJZTX-III和rJZTX-46融合蛋白中SUMO標(biāo)簽的Ulp激酶的制作工藝。由于以往購買Ulp激酶的費用很高，我們利用