calpain及calpastatin在小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中作用的研究.pdf

1、皮膚創(chuàng)傷后的修復(fù)反應(yīng)首先是血液凝固、血小板激活，然后，炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞等趨化、增殖，最后是肉芽組織經(jīng)改建成熟形成纖維結(jié)締組織。在此期間，機(jī)體通過凋亡機(jī)制清除“多余”細(xì)胞，調(diào)控?fù)p傷區(qū)域的細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡，保證受損組織的修復(fù)。我們的前期研究結(jié)果表明，在皮膚損傷愈合過程中，caspase—3，—6，—7可能在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中發(fā)揮重要作用。 Calpain是鈣激活中性蛋白酶(calc

2、ium—activated neutral protease)，涉及到細(xì)胞骨架的重塑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡。Calpain1和calpain2廣泛分布于絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織中。Calpain是由分子量為80KD的催化亞單位和分子量為30KD的調(diào)解亞單位組成的異二聚體。Calpain與Ca2+結(jié)合后自溶激活。目前尚未見有報(bào)道研究皮膚創(chuàng)傷后calpain1和calpain2的表達(dá)及活性變化，也未見研究calpain抑制劑對(duì)皮膚損傷愈

3、合影響的報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)采用H．E染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測(cè)、比色法等技術(shù)方法檢測(cè)小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1、calpain2和其內(nèi)源性抑制劑calpastatin的表達(dá)和激活情況，同時(shí)應(yīng)用calpain抑制劑MDL28170，觀察calpain和caspase—3的活性變化，研究calpain是否在皮膚損傷愈合過程中被激活以及calpain—calpastatin系統(tǒng)變化情況，為calpain在皮膚

4、凋亡中的作用和與caspase—3關(guān)系研究提供幫助。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 健康成年清潔級(jí)昆明系小鼠124只，雌雄不限，鼠齡8周，體重28—32克，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中有9只小鼠因傷后感染未被分組計(jì)數(shù)，其余115只小鼠隨機(jī)分為23個(gè)組，每組5只。9個(gè)損傷組按傷后0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d分組及其一個(gè)正常皮膚對(duì)照組。6個(gè)抑制劑組給予calpain抑制劑，按傷后6h、12h、1d、

5、3d、5d和7d分組。7個(gè)對(duì)照組包括6個(gè)抑制劑對(duì)照組和1個(gè)假手術(shù)組，給予DMSO生理鹽水稀釋液。 給予乙醚吸入麻醉后，在小鼠背部中央作一1.5cm長縱行皮膚全層切口。在規(guī)定實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)將小鼠頸椎脫位處死。用100％DMSO將MDL28170溶解，再用生理鹽水配制成濃度為1mg/ml的MDL28170注射液(DMSO終濃度為2％)。抑制劑組切創(chuàng)后即首次腹腔內(nèi)注射，劑量為24mg/kg，以后每12小時(shí)重復(fù)給藥一次，并在處死前2h再給藥

6、一次，每次劑量為12mg/kg。對(duì)照組小鼠按體重給予與抑制劑組相同劑量的含2％DMSO的生理鹽水。在皮膚創(chuàng)口處剪取1.5cm×1.0cm皮膚組織處理后進(jìn)行H．E.染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測(cè)和calpain、caspase—3的酶活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，在SPSS for Windows12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 第一部分：皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain及calpast

7、atin表達(dá)的研究 1、皮膚切創(chuàng)愈合的病理形態(tài)學(xué)變化 傷后6h，可見多型核細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)命名，主要為中性粒細(xì)胞)浸潤增多；傷后12h，皮下組織內(nèi)有大量滲出和浸潤的多型核細(xì)胞及少量單個(gè)核細(xì)胞；傷后1d，創(chuàng)緣周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤，以單個(gè)核細(xì)胞為主；傷后3d，肉芽組織增多，成纖維細(xì)胞開始增生；傷后5d，炎細(xì)胞減少，大量新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞及纖維細(xì)胞出現(xiàn)：傷后7d，肉芽組織大量形成，成纖維細(xì)胞增生達(dá)高峰；傷后10～

8、14d，肉芽組織開始纖維化。 2、皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1、calpain2和calpastatin免疫組織化學(xué)研究 calpain1、calpain2和calpastatin陽性表達(dá)主要分布于多型核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(細(xì)胞種類主要根據(jù)形態(tài)來區(qū)分)。三者的陽性細(xì)胞比率存在時(shí)間規(guī)律性。 3、皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1、calpain2和calpastatin蛋白表達(dá)的研究 c

9、alpain1、calpain2和calpastatin的表達(dá)存在時(shí)間規(guī)律性變化，calpain1和calpain2前體蛋白表達(dá)在傷后5d達(dá)高峰，其裂解片段的表達(dá)分別在傷后3d和5d明顯增多，calpastatin降解片段在傷后3d表達(dá)最大。 4、calpain和caspase—3酶活性檢測(cè) 傷后1d，calpain相對(duì)活性值大幅度升高(187.377±7.136％)，經(jīng)過明顯下降之后，傷后5d，再次升高達(dá)最大值(208

10、.253±6，098％)。傷后12h至5d，caspase—3活性倍數(shù)增值持續(xù)升高至最大值(41.095±2.022)，經(jīng)過明顯下降之后，傷后10d，再次升高(39，635±1.575)。 第二部分：calpain抑制劑MDL28170對(duì)小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程的影響觀察 1、calpain抑制劑MDL28170對(duì)病理形態(tài)學(xué)變化的影響 抑制劑組皮膚創(chuàng)口愈合過程較對(duì)照組快。傷后7d，組織學(xué)觀察到抑制劑組小鼠皮膚切創(chuàng)區(qū)較

11、對(duì)照組新增長上皮層次多，活躍，表皮完全愈合。 2、calpain抑制劑MDL28170對(duì)calpain1、calpain2和calpastatin表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)研究 抑制劑組傷后1d，calpain1陽性細(xì)胞率明顯增加至高峰，達(dá)(61.526±6.422％)，傷后3d，明顯下降，在傷后5d至7d，陽性細(xì)胞率明顯增加。各抑制劑組陽性細(xì)胞率與相應(yīng)對(duì)照組相比較均存在顯著性差異。 抑制劑組傷后6h至12h，cal

12、pain2陽性細(xì)胞數(shù)呈小幅度增加，在傷后1d，下降至最低(43.760±5.295％)，以后，陽性細(xì)胞率逐漸增加，至傷后7d，陽性細(xì)胞率達(dá)高峰(53.940±4.589％)。各抑制劑組陽性細(xì)胞率與相應(yīng)對(duì)照組相比較均存在顯著性差異。 抑制劑組calpastatin陽性細(xì)胞率在傷后6h最低(36.962±4.541％)，在傷后1d至7d，陽性細(xì)胞率逐漸增加，至傷后7d達(dá)高峰(87.799±4，941％)。從傷后12h至7d，抑制劑組

13、的calpastatin陽性細(xì)胞率與相應(yīng)對(duì)照組相比較均存在顯著性差異。 從傷后6h至7d，抑制劑組的calpain1和calpain2陽性細(xì)胞率明顯低于對(duì)照組。從傷后12h至7d，抑制劑組的calpastatin陽性細(xì)胞率明顯高于對(duì)照組。 3、calpain抑制劑MDL28170對(duì)calpain1、calpain2和calpastatin表達(dá)影響的蛋白表達(dá)研究 抑制劑組calpain1和calpain2前體蛋白雜

14、交條帶染色強(qiáng)度以傷后6h時(shí)為最低，隨損傷時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，在傷后7d達(dá)最大。傷后6h至7d，檢出染色強(qiáng)度較弱的calpain1和calpain2裂解片段蛋白雜交條帶。 抑制劑組calpastatin82kDa裂解片段蛋白雜交條帶染色強(qiáng)度在傷后6h最低，以后逐漸增加，在傷后7d達(dá)最大。從傷后6h開始，calpastatin50kDa裂解片段蛋白雜交條帶染色強(qiáng)度逐漸增加，至傷后3d達(dá)最大，以后蛋白雜交條帶染色強(qiáng)度逐漸下降。

15、 除7d外，抑制劑組calpain1前體表達(dá)明顯低于對(duì)照組，抑制劑組calpain1和calpain2活性片段表達(dá)明顯低于對(duì)照組。Calpastatin裂解片段雜交條帶染色強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組。 4、calpain抑制劑MDL28170對(duì)calpain和caspase—3酶活性影響的研究 在傷后6h至ld抑制劑組calpain相對(duì)活性值開始逐漸增加，傷后3d有所下降，在傷后5d，其相對(duì)活性值達(dá)最大(151.667±5.4

16、87％)，在傷后7d達(dá)最低值(131.730±7.087％)。 抑制劑組caspase—3活性倍數(shù)增值在傷后6h最低(5.952±1.407)，以后逐漸增加，至5d達(dá)高峰(30.270±1.830)。 傷后12h至7d，抑制劑組calpain相對(duì)活性值和caspase—3活性倍數(shù)增值均明顯低于對(duì)照組。 結(jié)論： 1、正常小鼠皮膚中calpain1、calpain2和calpastatin在表皮層、汗腺、毛囊

17、和皮肌層定位表達(dá)。 2、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain1和calpain2均被激活。 3、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中calpain在caspase—3上游參與細(xì)胞凋亡。 4、抑制calpain活性可加速了小鼠皮膚切創(chuàng)愈合進(jìn)程。 5、calpain參與單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生，并有可能與單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。 6、calpain1有望成為皮膚損傷時(shí)間推斷上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的參考指標(biāo)。