環(huán)丙氨嗪ELISA檢測(cè)方法的初步研究.pdf

1、環(huán)丙氨嗪是一種廣譜殺蟲劑，畜禽體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為三聚氰胺，其危險(xiǎn)性已引起人們高度關(guān)注。環(huán)丙氨嗪經(jīng)飼料攝入畜禽體內(nèi)后2-14％的代謝產(chǎn)物為三聚氰胺，容易引發(fā)食品安全事故。本研究擬通過(guò)抗原合成、多克隆抗體制備等途徑建立快速的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，主要采用戊二醛橋連法，偶聯(lián)半抗原環(huán)丙氨嗪和載體牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA），制備酶聯(lián)檢測(cè)的免疫抗原和包被抗原。經(jīng)紫外光譜和氣相-縛立葉-紅外光譜鑒定，在紫外265nm 波長(zhǎng)處得到環(huán)丙氨嗪

2、-BSA 吸收峰；在紅外3350-3300cm-1、1660-1500cm-1和1695-1665cm-1 波長(zhǎng)處分別得到環(huán)丙氨嗪-BSA和環(huán)丙氨嗪-OVA 特征性偶聯(lián)吸收峰，證實(shí)本次人工合成的這二對(duì)抗原均偶聯(lián)成功?？乖悸?lián)比計(jì)算，免疫抗原和包被抗原的偶聯(lián)比分別達(dá)到25.9:1、23.1:1，為進(jìn)一步制備抗血清或抗體奠定了工作基礎(chǔ)，為構(gòu)建ELISA 試劑盒制備了必要的人工抗原。
　　 用免疫原免疫兔子獲得了多克隆抗體，間接ELI

3、SA 檢測(cè)效價(jià)，以兩倍的陰性血清OD 值的陽(yáng)性血清的稀釋度為效價(jià)，達(dá)到16000。通過(guò)辛酸-硫酸銨二步沉淀法純化抗血清，對(duì)固相載體、包被緩沖液、包被溫度、時(shí)間、溶劑等因素的篩選試驗(yàn)比較，優(yōu)化了酶聯(lián)免疫分析的條件。結(jié)果表明，用0.05M pH 9.6CBS 稀釋包被抗原，在4℃下包被12h 效果最佳，添加5％甲醇的0.01M pH7.4 PBS 稀釋抗體，最有利于抗原抗體反應(yīng)，最有利于抗原抗體反應(yīng)。采用優(yōu)化后的分析條件，用直接競(jìng)爭(zhēng)ELIS

4、A方法進(jìn)行了抗體親和力和特異性研究。結(jié)果表明，抗環(huán)丙氨嗪抗體對(duì)環(huán)丙氨嗪的特異性較低，IC50 值較高，不能滿足殘留檢測(cè)的要求。
　　 環(huán)丙氨嗪和蛋白偶聯(lián)后，三嗪環(huán)和環(huán)丙氨基的特征結(jié)構(gòu)被蛋白質(zhì)大分子所掩蔽，不能被機(jī)體很好的識(shí)別，是ELISA 檢測(cè)靈敏度較低的原因。因此，本論文設(shè)計(jì)了能夠最大化保留環(huán)丙氨嗪結(jié)構(gòu)特征的系列半抗原結(jié)構(gòu)，并對(duì)其合成路線進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，最終分別以環(huán)丙氨嗪、三聚氯氰為起始原料，經(jīng)琥珀酸化，巰基丁酸化及丁羥基化