羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1b在肝細(xì)胞性肝癌中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1b是一種重要的催化類固醇硫酸化反應(yīng)的酶，高選擇性的催化3β-羥基類固醇。近年研究發(fā)現(xiàn)，氧化固醇代謝與癌癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系。目前，SULT2B1與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌的關(guān)系已有個別報道，但SULT2B1b和肝細(xì)胞性肝癌的關(guān)系尚無相關(guān)研究。關(guān)于SULT2B1b在肝臟中的生物學(xué)功能研究表明，SULT2B1b主要通過調(diào)控肝X受體(Liver X receptor, LXR)參與了肝臟的氧化固

2、醇硫酸化、脂質(zhì)代謝、肝部分切除后的肝再生過程，并可促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。據(jù)此我們推測，SULT2B1b可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，通過調(diào)控SULT2B1b的表達(dá)水平可影響肝癌的進(jìn)程。因此，本研究將從肝癌細(xì)胞增殖與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的角度，通過體內(nèi)外實驗，闡明SULT2B1b表達(dá)水平的改變與肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的關(guān)系及具體的分子機(jī)制。因此，本研究包含兩部分內(nèi)容:一方面，研

3、究SULT2B1b對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖和血管新生的調(diào)節(jié)作用;另一方面，利用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片研究SULT2B1b對下游基因的表達(dá)調(diào)控，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子芯片結(jié)果，對SULT2B1b與肝細(xì)胞肝癌EMT間的關(guān)系及表達(dá)調(diào)控機(jī)制做初步探討。
　　第一部分:羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1b對肝細(xì)胞肝癌體內(nèi)外增殖和血管新生的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。Western blot結(jié)果表明，SULT2B1b在小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中的表達(dá)較正常小鼠肝組織及

4、小鼠原代肝細(xì)胞顯著增高。CCK8增殖實驗結(jié)果顯示，腺病毒介導(dǎo)的SULT2B1b過表達(dá)顯著促進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞的體外增殖，反之，慢病毒介導(dǎo)的SULT2B1b干擾對此有明顯的抑制作用。體內(nèi)外實驗結(jié)果均顯示，干擾SULT2B1b通過上調(diào)FAS和p-JNK，下調(diào)cyclinB1、BCL2和MYC的基因與蛋白表達(dá)水平，引起Hepa1-6細(xì)胞G2/M期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示，干擾SULT2B1b可明顯抑制Hepa1-6細(xì)

5、胞移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長。進(jìn)一步研究表明，SULT2B1b在人肝癌組織中高表達(dá)，并且SULT2B1b的表達(dá)水平和人肝癌細(xì)胞株(Huh-7，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7402)的增殖能力密切相關(guān)。干擾SULT2B1b可抑制SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞的增殖能力，同時降低cyclinB1的表達(dá)水平，并抑制BEL-7402細(xì)胞瘤在裸鼠體內(nèi)的生長。此外，在Hepa1-6細(xì)胞中，干擾SULT2B1b的腫瘤條件培養(yǎng)基可明顯

6、抑制bEnd.3細(xì)胞的體外增殖，抑制SULT2B1b的表達(dá)可降低Hepa1-6細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中的微血管密度。上述研究結(jié)果表明，SULT2B1b能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖和血管新生。
　　第二部分:羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1b在肝細(xì)胞肝癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用及調(diào)控機(jī)制。我們利用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片，研究345種轉(zhuǎn)錄因子在SULT2B1b調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用。結(jié)果顯示，在BEL-7402細(xì)胞中，干擾SUL

7、T2B1b表達(dá)，共有168個點的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)具有差異（2倍增強或減弱被判斷為有意義）。其中32個點的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，136個點的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，包括與腫瘤EMT發(fā)生相關(guān)的ZEB1和Snail的轉(zhuǎn)錄活性也顯著降低。同時我們分別在高表達(dá)SULT2B1b的人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和低表達(dá)SULT2B1b的小鼠原代肝細(xì)胞中，研究了SULT2B1b與肝細(xì)胞肝癌EMT間的關(guān)系及其在肝細(xì)胞EMT進(jìn)程中的作用。Western blot結(jié)果進(jìn)一步

8、表明，干擾SULT2B1b通過降低ZEB1的表達(dá)，上調(diào)ZO-1的蛋白水平，抑制BEL-7402細(xì)胞EMT的發(fā)生。此外，在小鼠原代肝細(xì)胞中，SULT2B1b過表達(dá)通過調(diào)控ZEB1和Snail1的表達(dá)水平，引起E-cadherin下調(diào)、Vimentin上調(diào)，促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞EMT的進(jìn)程。結(jié)果提示，SULT2B1b可能通過調(diào)控與EMT發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子活性，影響上皮與間質(zhì)標(biāo)志分子的表達(dá)，進(jìn)而參與肝細(xì)胞肝癌EMT的發(fā)生與進(jìn)展。<

9、br>　　綜上所述，羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1b在肝癌組織中高表達(dá)，并且與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。干擾SULT2B1b的表達(dá)顯著抑制肝癌細(xì)胞株的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，使肝癌細(xì)胞促血管新生能力受阻。其機(jī)制主要與上調(diào)FAS、p-JNK，抑制BCL2、MYC、降低cyclin B1的表達(dá)水平及蛋白穩(wěn)定性，引起細(xì)胞周期G2/M期阻滯有關(guān)。此外，SULT2B1b通過調(diào)控與EMT發(fā)生相關(guān)等多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響上皮與間質(zhì)標(biāo)志分