體內(nèi)外研究羥基膽固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT2B1b)及其硫化產(chǎn)物對肝臟增生的影響及機(jī)制.pdf

1、前言
　　 胞漿硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)2B1b能夠催化膽固醇及羥基膽固醇的3β-羥基硫酸化，其催化25-羥化膽固醇(25HC)硫酸化反應(yīng)的主要產(chǎn)物為3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)。研究發(fā)現(xiàn)SULT281b能夠抑制羥基膽固醇對肝X受體(LXRs)的激活，并且其硫酸化產(chǎn)物可以通過抑制LXR/SREPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平。而LxRs信號途徑的激活對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用。因此SULT2B1b及其硫化產(chǎn)物25HC

2、3S可能對肝臟增生起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們在小鼠正常肝臟、原代大鼠肝臟細(xì)胞(PRH)以及小鼠肝臟部分切除術(shù)(PH)模型中研究SULT281b對肝臟增生的作用及機(jī)制，并在小鼠正常肝臟中檢測SULT281b的硫化產(chǎn)物25HC3S對肝臟增生的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　 第一部分體內(nèi)外研究SULT2B1b對肝臟增生的影響
　　 第一節(jié) SULT2B1b對小鼠肝臟增生以及原代大鼠肝細(xì)胞(PRH)生長的影響及相關(guān)機(jī)制
　　 目

3、的：探索SULT2B1b對小鼠肝臟以及PRH增生的影響及機(jī)制。
　　 方法：將含有SULT2B1b基因的腺病毒感染C57BL/6小鼠及PRH后，運(yùn)用PCNA免疫組織化學(xué)染色法檢測肝臟增生狀態(tài)；應(yīng)用免疫熒光雙染法定位肝臟內(nèi)SULT281b與PCNA的表達(dá)；采用siRNA干擾技術(shù)反面驗(yàn)證SULT281b對肝細(xì)胞生長的影響；通過實(shí)時定量PCR和免疫印跡的方法檢測基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明小鼠肝臟組織中的PCNA陽

4、性細(xì)胞率隨SULT281b表達(dá)水平的升高而明顯增加，并存在劑量和時間依賴性；肝臟內(nèi)幾乎所有存在PCNA表達(dá)的細(xì)胞核均伴隨SULT2B1b在細(xì)胞質(zhì)的高表達(dá)，而沒有SULT2B1b表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)也檢測不到PCNA的表達(dá)。在SULT281b相對高表達(dá)的PRH內(nèi)，采用RNA干擾技術(shù)抑制SULT281b基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因CDK2，F(xiàn)oxM1b，與Cyclin A的表達(dá)明顯降低。此外，LXR人工合成激動劑T0901317可有效阻斷體內(nèi)外

5、SULT281b所誘導(dǎo)的PCNA表達(dá)升高。
　　 結(jié)論：SULT281b能夠通過抑制LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性促進(jìn)體內(nèi)外肝細(xì)胞增生。
　　 第二節(jié)在部分肝切除術(shù)(PH)后的小鼠模型中研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機(jī)制
　　 目的：研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機(jī)制。
　　 方法：在C57BL/6小鼠體內(nèi)建立肝臟PH再生模型，并通過尾靜脈注射含有SULT2B1b基因的腺病毒或?qū)φ詹《?；病毒感?/p>

6、5天后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法分析肝再生過程中的PCNA陽性細(xì)胞率；采用HPLC技術(shù)檢測肝臟內(nèi)羥基膽固醇的變化；運(yùn)用實(shí)時定量PCR和免疫印跡法檢測基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：SULT281b過表達(dá)的小鼠肝臟恢復(fù)較快，約于術(shù)后三天恢復(fù)到肝臟原始大小的80％，而對照組需要將近5天達(dá)到同樣水平。SULT281b過表達(dá)增加了肝臟再生過程中的PCNA陽性細(xì)胞率以及增生相關(guān)基因的表達(dá)水平；降低了肝臟內(nèi)的羥基膽固醇含量以及LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下

7、游基因SREBP-1和ABCA1的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：SULT281b能夠通過抑制羥基膽固醇/LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)肝臟損傷后的再生。
　　 第二部分在小鼠體內(nèi)研究羥基膽固醇硫化物對肝臟增生的影響及其相關(guān)機(jī)制
　　 目的：探索SULT281b的硫化產(chǎn)物(25HC3S)對小鼠體內(nèi)肝臟增生的影響及機(jī)制
　　 方法：向C57BL/6小鼠尾靜脈直接注射3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)化合物，或向感染

8、了腺病毒(Ad-SULT281b)兩天后的C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射25HC，建立高濃度外源性或內(nèi)源性25HC3S的小鼠模型；應(yīng)用[3H]標(biāo)記25HC3S并經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)，追蹤25HC3S在各組織器官中的分布及其藥代動力學(xué)；采用實(shí)時定量PCR，細(xì)胞周期PCR芯片以及免疫印跡法檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。以PCNA為增生標(biāo)記，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析肝臟中PCNA的陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果：外源性25HC3S給藥后在小鼠體內(nèi)廣

9、泛分布于各組織器官，并在注射后48小時左右減至初始劑量的一半；25HC3S的增加上調(diào)了肝臟內(nèi)增牛相關(guān)基因Wt1，Pcna，cMyc，cyclin A，F(xiàn)oxM1b，CDC25b的表達(dá)，卻下調(diào)了細(xì)胞周期停滯基因Check2以及凋亡誘導(dǎo)基因Apaf1的表達(dá)；無論外源性給藥還是內(nèi)源性合成，25HC3S的應(yīng)用均有效增加了PCNA陽性細(xì)胞率，降低了LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游基因如ABCA1和SREBP-1c的表達(dá)；最后，LXR的人工合成激動劑T090