酵母在不同培養(yǎng)環(huán)境下中間代謝途徑代謝調(diào)控過(guò)程的研究.pdf

1、隨著酵母完整的基因測(cè)序已經(jīng)基本完成，人類第一次獲得了真核細(xì)胞生物基因組的完整核苷酸序列，酵母基本的代謝過(guò)程也已經(jīng)了解。同時(shí)酵母又是一種重要的工業(yè)微生物，也是代謝工程的基礎(chǔ)研究中一種較好的模式生物。但對(duì)于其在不同條件、不同的環(huán)境及生長(zhǎng)的不同階段等情況下胞內(nèi)產(chǎn)生的系統(tǒng)而精細(xì)的代謝過(guò)程的調(diào)控還不是十分清楚，這些方面的研究一直以來(lái)就是基礎(chǔ)理論與生產(chǎn)實(shí)踐中的熱點(diǎn)問(wèn)題。本文通過(guò)發(fā)酵過(guò)程生長(zhǎng)參數(shù)的分析、酶活性檢測(cè)、蛋白質(zhì)組分析和代謝通量分析研究了S.

2、cerevisiae利用不同的碳源和不同生長(zhǎng)階段時(shí)，胞內(nèi)代謝體系的響應(yīng)及細(xì)胞自身的這種代謝調(diào)控的機(jī)理。 考察了酵母中間代謝途徑中一些關(guān)鍵酶活性，包括糖酵解途徑(丙酮酸激酶，pyk)，磷酸戊糖途徑(6-磷酸葡萄糖脫氫酶，G6PDH)，三羧酸循環(huán)(異檸檬酸脫氫酶，ICDH；α-酮戊二酸脫氫酶，2-KGDH)，和糖異生途徑(FBPase)以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)。采用固相pH梯度-SDS聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳對(duì)釀酒酵母S

3、.cerevisiae利用不同碳源和培養(yǎng)的不同階段時(shí)細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行分離，使用2D蛋白質(zhì)圖像分析系統(tǒng)Imagemaster2DElite對(duì)雙向電泳圖譜進(jìn)行定量分析。以MIPS酵母代謝數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，建立了包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、一些回補(bǔ)反應(yīng)、發(fā)酵途徑的中間代謝途徑和氨基酸生物合成途徑等的代謝模型，并根據(jù)反應(yīng)機(jī)理，以原子映射矩陣對(duì)其反應(yīng)中的碳原子去向進(jìn)行描述。對(duì)于同種物質(zhì)相互之間進(jìn)行的雙分子反應(yīng)，對(duì)其原子映射矩陣進(jìn)行拆分處

4、理，對(duì)稱分子生成非對(duì)稱分子的反應(yīng)，則需按兩條反應(yīng)路線計(jì)算。通過(guò)同模式標(biāo)記分子向量和原子映射矩陣來(lái)構(gòu)造同位素映射矩陣。在中間代謝產(chǎn)物平衡的基礎(chǔ)上，以分布向量、同位素映射矩陣和反應(yīng)映射矩陣等建立了同位素分布平衡的非線性限制條件系統(tǒng)。相對(duì)于傳統(tǒng)的代謝通量分析方法，不考慮不確定性大的輔酶因子NADH、NADPH和ADP、ATP等的平衡關(guān)系，以同位素平衡的限制條件來(lái)代替以往的最大化比生長(zhǎng)速率、最大化生物量、最小化能量需求、能量平衡等限制條件。對(duì)該

5、同位素平衡非線性系統(tǒng)的Jacobi矩陣偏微分解析形式做一些理論探討。采用K.Schmidt等學(xué)者提出的均值迭代法(iterativeaveraging)來(lái)計(jì)算同位素的穩(wěn)態(tài)分布。以胞外代謝產(chǎn)物的測(cè)量值、氨基酸13C標(biāo)記模式分布信息與計(jì)算值之間的偏差作為初始適應(yīng)度函數(shù)，對(duì)其進(jìn)行線性定標(biāo)，根據(jù)個(gè)體的適應(yīng)度函數(shù)值所度量的優(yōu)、劣程度決定它所攜帶的自由通量信息在下一代是被淘汰還是被遺傳。結(jié)果表明，適應(yīng)度較大(優(yōu)良)個(gè)體有較大的存在機(jī)會(huì)，而適應(yīng)度較小

6、(低劣)的個(gè)體繼續(xù)存在的機(jī)會(huì)也較小。以自然選擇和群體遺傳理論為基礎(chǔ)，模擬生物進(jìn)化過(guò)程中適者生存規(guī)則和群體內(nèi)部染色體的信息隨機(jī)交換機(jī)制，并輔以SSP作為局部?jī)?yōu)化方法，雜合基因算法被整合在代謝通量分析中。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在葡萄糖作碳源的對(duì)數(shù)期時(shí)，為了有效地利用葡萄糖，葡萄糖激酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶表現(xiàn)了較高的表達(dá)量，相應(yīng)地在葡萄糖消耗完的后期和乳酸作碳源時(shí)上述兩種酶的表達(dá)量較低或未被檢測(cè)到。磷酸甘油酸激酶、烯醇酶和丙酮酸激酶也都在以葡

7、萄糖為碳源時(shí)顯示了較高的表達(dá)量，此時(shí)丙酮酸激酶的酶活性也比葡萄糖消耗光的后期和乳酸作為碳源的情況高很多，表明在利用葡萄糖為碳源時(shí)相對(duì)于利用乙醇和乳酸時(shí)，糖酵解途徑要更活躍。這種趨勢(shì)在磷酸戊糖途徑的氧化階段尤為明顯。而作為DNA、RNA、色氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸等生物合成前體的4-磷酸赤蘚糖和5-磷酸核糖主要由磷酸戊糖途徑的非氧化階段來(lái)提供。對(duì)乙醇的利用主要通過(guò)乙醛酸支路，生成的蘋(píng)果酸進(jìn)而在蘋(píng)果酸酶的作用下回補(bǔ)到丙酮酸，彌補(bǔ)了由于糖酵解

8、途徑的削弱而帶來(lái)的作為賴氨酸、異亮氨酸等前體的丙酮酸的損失。該結(jié)果與Cortassa等人的發(fā)現(xiàn)一致。而由于蘋(píng)果酸酶也包含NADP依賴的異構(gòu)體，所以也構(gòu)成了對(duì)削弱的磷酸戊糖途徑氧化階段(zwf)所帶來(lái)的NADPH損失的一種補(bǔ)償機(jī)制。磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)在吸收利用乙醇和乳酸時(shí)比利用葡萄糖作碳源時(shí)表現(xiàn)了較高的表達(dá)量，酶的活性比葡萄糖作為碳源時(shí)高3倍和6倍左右。說(shuō)明乙醇被轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，乳酸被轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)而被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A

9、，分別進(jìn)入三羧酸循環(huán)以后，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化的從草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸的回補(bǔ)反應(yīng)在這里起到了重要的糖異生的作用，與H.C.Lange的研究結(jié)果相符。 酶存在的量是它的合成和降解速率之間的一種平衡，酶活性檢測(cè)和蛋白質(zhì)組雙向電泳解析表明二者基本上成正相關(guān)。這是由于胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的水平受到其合成和降解速率的影響，同時(shí)mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核、在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的降解以及在核糖體上的翻譯都直接控制著酶的表達(dá)量，尤其是mRNA轉(zhuǎn)

10、錄的速率受到嚴(yán)格的控制。 在葡萄糖和甘油作為碳源時(shí)，菌體生物量得率幾乎相同，而在乙酸作為碳源時(shí)生物量得率相對(duì)較低，同時(shí)CO2生成速率和O2攝入速率較高，表明在這種條件下呼吸作用可能較為旺盛，在代謝通量的分析進(jìn)一步印證了這種現(xiàn)象。因?yàn)镾.cerevisiae合成細(xì)胞壁的需要，作為多糖合成的前體，6-磷酸葡萄糖成為中間代謝途徑內(nèi)最大的輸出源。在葡萄糖和甘油作為碳源培養(yǎng)時(shí)，相對(duì)于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶所催化的回補(bǔ)反應(yīng)，丙酮酸羧化酶所催

11、化的從丙酮酸到草酰乙酸的反應(yīng)在這種條件下為主要的回補(bǔ)反應(yīng)。 當(dāng)甘油作為碳源時(shí)，糖酵解途徑中的6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油酸之間的反應(yīng)的反應(yīng)方向與葡萄糖作為碳源時(shí)的情況相反，起到了糖異生的作用。而作為組氨酸、色氨酸和核苷酸的生物合成前體的5-磷酸核糖仍由磷酸戊糖途徑中的氧化途徑提供。在乙酸作為碳源時(shí)從乙酰輔酶A中流出的中間代謝途徑的代謝通量比較明顯地大于葡萄糖和甘油作為碳源的情況，這可能是由于在這種條件下，更多的從乙酰輔酶A合成脂

12、肪的需要，同時(shí)在利用乙酸作為碳骨架的來(lái)源時(shí)從乙酸到乙酰輔酶A的代謝路徑最短。TCA循環(huán)在這種情況下非常活躍，這也與發(fā)酵中的生長(zhǎng)相關(guān)參數(shù)和酶活性分析的結(jié)果一致。在利用乙酸作為碳源時(shí)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶所催化的從草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸的反應(yīng)有很大的通量，起到了重要的糖異生的作用。蘋(píng)果酸酶所催化的反應(yīng)在這種情況下比較活躍，補(bǔ)償了由于比較低的丙酮酸激酶活性而導(dǎo)致的丙酮酸的損失。 在葡萄糖和甘油作為碳源培養(yǎng)時(shí)，三羧酸循環(huán)和呼吸途

13、徑?jīng)]有提供足夠的NADPH，所以磷酸戊糖途徑的氧化階段比較活躍，成為這種情況下生物合成所需的NADPH的主要來(lái)源，同時(shí)作為DNA、RNA、色氨酸、組氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸等的生物合成前體的5-磷酸核糖和4-磷酸赤蘚糖主要由磷酸戊糖途徑中的氧化階段來(lái)提供，而在乙酸作為碳源的情況下5-磷酸核糖和4-磷酸赤蘚糖主要由磷酸戊糖途徑中的非氧化途徑來(lái)提供，作為一種補(bǔ)償機(jī)制，三羧酸循環(huán)比較活躍，NADPH在這種情況下主要來(lái)源于三羧酸循環(huán)。

14、在甘油作為碳源培養(yǎng)時(shí)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性比以葡萄糖為碳源時(shí)的情況稍高，與代謝通量分析的結(jié)果一致。與葡萄糖作為碳源的情況相比，在甘油和乙酸作為碳源時(shí)，該糖異生反應(yīng)通量的增大消耗了由于氧氣攝入速率和二氧化碳生成速率的增大而產(chǎn)生的更多的ATP，起到了均衡調(diào)控代謝過(guò)程的冗余循環(huán)(futilecycle)的作用。二磷酸果糖酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶所催化的反應(yīng)路線在利用甘油和乙酸作為碳源時(shí)成為糖異生的主要途徑，提供了可以被磷酸戊糖途徑的非氧化