識別子孢子TL Rs的鑒定及其抑制瘧原蟲肝期發(fā)育機(jī)制的研究.pdf

1、Toll樣受體(TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中非常重要的一類模式識別受體(PRRs),它們通過識別病原相關(guān)模式分子(PAMPs)啟動固有免疫從而抵抗外界病原體入侵。因此,天然免疫識別病原體成分成為宿主對病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的第一步。迄今為止,在對瘧原蟲天然免疫識別的研究中,鑒定出TLR2、TLR4以及TLR9參與了宿主固有免疫對瘧原蟲紅內(nèi)期的識別,而對于其他TLRs是否參與識別紅內(nèi)期成分仍不清楚。更重要的是由于受到高純度子孢子分離純化的技術(shù)限

2、制,對TLR受體是否參與天然免疫系統(tǒng)識別瘧原蟲子孢子未見報(bào)道。本研究利用過DE52柱的方式分離獲得了高純度的子孢子,通過建立檢測NF-κB及IFN-β報(bào)告基因活化的雙熒光素酶平臺和蚊叮咬小鼠的瘧疾感染平臺和改進(jìn)子孢子分離純化方法,發(fā)現(xiàn)TLR2能夠識別子孢子成分,并對其在瘧原蟲肝期生長發(fā)育中的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　一、利用雙熒光素酶平臺篩選可以識別瘧原蟲成分的TLR:
　　1、檢測TLRs活化雙熒光素酶平臺的建立:構(gòu)

3、建小鼠重組TLR1,TLR3,TLR4,MD-2,TLR5,TLR6,TLR7,TLR9真核表達(dá)質(zhì)粒,與NF-κB和IFN-β報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293FT,建立了檢測TLR活化的雙熒光素酶平臺。
　　2、識別子孢子TLRs的鑒定:利用解剖過柱的方法分離純化約氏瘧原蟲BY265株子孢子,反復(fù)凍融制備了裂解產(chǎn)物,經(jīng)檢測子孢子裂解產(chǎn)物內(nèi)毒素含量僅為11EU/ml;對感染小鼠心臟取血,經(jīng)超聲制備了裂解產(chǎn)物。利用雙熒光素酶平臺對裂解產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

4、,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TLR2、TLR2/1、TLR2/6、TLR4以及TLR9可被約氏瘧原蟲17XL株紅內(nèi)期成分所活化,說明成功建立了雙熒光素酶平臺;而約氏瘧原蟲BY265紅外期子孢子反復(fù)凍融產(chǎn)物僅以通過TLR2、TLR2/1及TLR2/6而不是其他TLR受體活化NF-κB(P<0.05)。
　　3、約氏瘧原蟲子孢子以TLR2依賴的方式刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子:分離WT,TLR2-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用制備好的約氏瘧原蟲子孢子裂解

5、產(chǎn)物進(jìn)行刺激,22-24h后,使用CBAMouseInflammationKit檢測培養(yǎng)上清細(xì)胞因子含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)子孢子依賴于TLR2信號通路促使巨噬細(xì)胞分泌IL-6、MCP-1和TNF-α(P<0.05)。
　　二、TLR2抑制肝期瘧原蟲發(fā)育及其機(jī)制研究:
　　1、約氏子孢子感染后,TLR2缺失導(dǎo)致肝期蟲荷和原蟲血癥的增加:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在尾靜脈注射子孢子及蚊叮咬感染實(shí)驗(yàn)中,TLR2和Myd88缺失小鼠的肝臟蟲荷明顯高

6、于WT小鼠(P<0.05)。而由于受到肝期蟲荷的影響,TLR2缺失小鼠的原蟲血癥和死亡率都明顯高于WT小鼠(P<0.05)。
　　2、活化TLR2能夠抑制約氏瘧原蟲肝期的生長發(fā)育:為了驗(yàn)證TLR2信號通路的作用,本研究將20μgTLR2激動劑LTA-BS、Pam3CSK4及FSL-1分別和子孢子一起經(jīng)尾靜脈注射至WT小鼠體內(nèi),隨后觀察小鼠肝臟蟲荷發(fā)現(xiàn),注射激動劑組小鼠肝臟蟲荷相比未注射組都有不同程度的降低(P<0.05)。表明活化

7、TLR2信號通路能夠抑制肝臟瘧原蟲的生長發(fā)育,降低蟲荷。
　　3、約氏子孢子感染后,TLR2缺失導(dǎo)致肝臟促炎癥因子的下調(diào):對小鼠肝臟的促炎癥因子mRNA水平進(jìn)行染料q-PCR檢測。發(fā)現(xiàn)無論采用尾靜脈注射子孢子或是蚊叮咬方式感染,感染后的TLR2缺失小鼠比的感染后的WT小鼠,其肝臟中IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12p40和IL-10mRNA水平都有不同程度的下調(diào)(P<0.05)。
　　4、TLR2的缺失同樣促進(jìn)伯氏

8、瘧原蟲肝期的生長發(fā)育:為了探究TLR2信號通路在其他瘧原蟲種屬感染中的作用,本研究采用自然叮咬感染的方式,使感染伯氏瘧原蟲ANKA株17天的雌性按蚊叮咬WT和TLR2缺失小鼠,42小時(shí)后,定量檢測其肝臟蟲荷,發(fā)現(xiàn)TLR2缺失小鼠肝臟蟲荷及死亡率均高于WT小鼠(P<0.05)。
　　本研究通過建立雙熒光素酶平臺的篩選,首次發(fā)現(xiàn)了瘧原蟲子孢子可以通過TLR2活化NF-κB,而TLR2缺失之后的小鼠抵御肝期瘧原蟲感染能力明顯下降,其原因