人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用.pdf

1、目的： 人參皂甙Rg3是一種從紅參中提取的中藥單體，為抗腫瘤新藥。研究顯示，Rg3具有抑制多種腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生成、提高機(jī)體免疫力，聯(lián)合化療有增效減毒作用等。但其抑制腫瘤作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。 EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，在多種惡性腫瘤高表達(dá)，其異?；罨c腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為以及腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。EGFR為受體型酪氨酸蛋白激酶，EGFR激活的關(guān)鍵步驟為二聚體形成及酪氨酸自

2、身磷酸化。酪氨酸磷酸化可募集含有SH2結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子，從而將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游分子，導(dǎo)致一系列下游信號(hào)通路的激活。 本實(shí)驗(yàn)研究人參皂甙Rg3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的影響，提出人參皂甙Rg3可能以EGFR為作用靶點(diǎn)，通過(guò)抑制EGFR信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗腫瘤作用，為臨床應(yīng)用人參皂甙Rg3的抗腫瘤靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并將深入探討Rg3抗腫瘤作用機(jī)制具有較大意義。 方法： 1．體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株M

3、CF-7，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。 2．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的人參皂甙Rg3，作用后，MCF-7細(xì)胞EGFR、磷酸化EGFR(pEGFR)和PY20(磷酸化的酪氨酸激酶)的表達(dá)水平。 3．細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)不同濃度的人參皂甙Rg3作用后，MCF-7細(xì)胞EGFR、pEGFR和PY20的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．不同濃度的Rg3作用一定時(shí)間(24h，48h

4、)后，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用：人參皂甙Rg3(12.51μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)和輔料(50μg/ml)分別作用于MCF-7細(xì)胞。形態(tài)學(xué)分析，顯微鏡下可見，經(jīng)藥物作用后MCF-7細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的貼壁良好、飽滿、多角形、梭形變?yōu)轭悎A形、懸浮、顏色變暗、無(wú)折光性，且隨藥物濃度的增加細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞的差異越大；輔料組MCF-7細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量

5、變化不大。24h后抑制率分別為10.3％、15.2％、20.7％、26.3％、50.4％、92.7％，輔料組抑制率為22.6％。Rg3處理組與空白對(duì)照組比較，濃度≥100μg/ml均明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：48h后抑制率分別為6.0 ％、12.4％、30.3％、60.6％、69.1％、74.0％，輔料組抑制率為14.8％。Rg3處理組與空白對(duì)照組比較，濃度≥25μg/ml均能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

6、<0.05)。 2．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參皂甙Rg3作用后，MCF-7細(xì)胞中EGFR、pEGFR和PY20的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，表達(dá)比例為25μg/ml(40.32±0.84)％、50μg/ml(32.09±1.63)％、100μg/ml(25.22±2.15)％、200μg/ml(15.17±0.95)％，明顯低于對(duì)照組(71.54±1.89)％和輔料組(68.49±2.87)％， (p<0.0

7、5)；pEGFR的表達(dá)比例為25μg/ml(38.16±0.79)％，50μg/ml(27.94±0.59)％，100μg/ml(19.22±1.41)％，200μg/ml(10.53±0.99)％，明顯低于對(duì)照組(57.10±0.35)％和輔料組(54.49±0.43)％， (P<0.05)：PY20的表達(dá)比例為25μg/ml(38.90±1.01)％，50μg/ml(25.73±1.19)％，100μg/ml(17.64±1.29)

8、％，200μg/ml(9.73±0.75)％，明顯低于對(duì)照組(53.98±1.16)％和輔料組(58.04±0.96)％， (P<0.05)。而且pEGFR和PY20的整體表達(dá)比例低于EGFR的表達(dá)比例，符合正常規(guī)律。 3．人參皂甙Rg3作用后，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)MCF-7細(xì)胞膜表面EGFR表達(dá)隨著藥物濃度的升高，熒光強(qiáng)度逐漸減弱,對(duì)照組細(xì)胞膜表面的熒光強(qiáng)度高于藥物組。細(xì)胞膜表面pEGFR和PY20的表達(dá)趨勢(shì)同EGFR抗體組。

9、 結(jié)論： 1．人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞有一定的抑制作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力呈時(shí)間劑量依賴性。 2．在一定的濃度范圍內(nèi)(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)，人參皂甙Rg3能降低MCF-7細(xì)胞表面EGFR，pEGFR的表達(dá)以及PY20的表達(dá)。隨著藥物濃度的增加，EGFR，pEGFR，PY20的表達(dá)逐漸降低，呈劑量依賴性，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3．MCF-7細(xì)胞經(jīng)人參