STAT1反義寡核苷酸霧化吸入轉(zhuǎn)染肺纖維化大鼠模型的建立與鑒定.pdf

1、目的：探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)反義寡核苷酸霧化吸入體內(nèi)轉(zhuǎn)染肺纖維化大鼠的可行性并給予鑒定。 方法：根據(jù)大鼠STAT1基因的堿基序列設(shè)計(jì)合成硫代修飾的反義寡核苷酸，5’端異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記。取20只體重為180-200g的雌性Wistar大鼠，氣管

2、內(nèi)灌注博萊霉素7天后，隨機(jī)分為生理鹽水(normalsaline，NS)組5只、脂質(zhì)體(liposome，LP)組5只、反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASON)組10只，其中ASON組又分為2個(gè)亞組。NS組、LP組和ASON組分別于氣管內(nèi)灌注博萊霉素第7天、9天、11天、13天隔日霧化吸入生理鹽水(NS組)、DOTAP(LP組)、DOTAP-ASON復(fù)合物(ASON組)，共霧化吸入4次，其

3、中ASON組5只大鼠霧化全硫代磷酸修飾的STATI-ASON，5只大鼠霧化全硫代磷酸修飾并5’端FITC標(biāo)記的STAT1-ASON。3組大鼠于氣管內(nèi)灌注博萊霉素第14天處死，其中ASON組中霧化5’端FITC標(biāo)記的STAT1-ASON的5只大鼠于霧化完5～6小時(shí)后處死。通過支氣管肺泡灌洗液收集肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)，肺組織作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察，了解STAT1-ASON是否進(jìn)入了AM和肺組織

4、內(nèi)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(real time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)AM中STAT1/ICAM-1mRNA的表達(dá)。并檢測(cè)血清肝腎功能指標(biāo)，收集支氣管肺泡灌洗液作細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)檢測(cè)，肺組織常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，肺組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：熒光顯微鏡觀察見AM和肺組織中可見黃綠色熒光。NS組、LP組、ASON組血清肝功能指標(biāo)

5、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)以及腎功能指標(biāo)尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。FQ-PCR結(jié)果顯示：NS組和LP組相比，AM中ICAM-1、STAT1mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；NS組、LP組與ASON組相比，AM中ICAM-1、STAT1mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ASON組與NS組相比，ICAM-1、STAT1mRNA表達(dá)

6、水平顯著F降，抑制率分別達(dá)73.29％、73.35％。支氣管肺泡灌沈液細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果顯示：NS組與LP組細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；NS組和LP組分別與ASON組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)：ASON組細(xì)胞總數(shù)減少，巨噬細(xì)胞比例增加，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例減少。肺組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)：NS組和LP組肺泡炎程度較重：肺泡壁增厚，肺泡腔及肺泡壁有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病變區(qū)域肺泡萎縮。而ASON組肺泡炎程度相