一個(gè)新克隆的microRNA調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分一個(gè)新microRNA的克隆及其在破骨細(xì)胞分化過程中作用的研究
　　目的:
　　篩選新的小鼠破骨細(xì)胞特異性表達(dá)或優(yōu)勢表達(dá)的microRNA，研究其在小鼠體內(nèi)不同組織和細(xì)胞的表達(dá)譜及在破骨細(xì)胞分化過程中的作用。
　　方法:
　　將小鼠原代成骨細(xì)胞與骨髓細(xì)胞共同培養(yǎng)獲得原代破骨細(xì)胞，分離并克隆細(xì)胞內(nèi)所有小RNA，并與已知的小RNA進(jìn)行比對鑒定了一個(gè)新的microRNA，提交miRBase數(shù)據(jù)庫注冊后命名為mi

2、R-9718;應(yīng)用Northern Blot測定小鼠不同組織及細(xì)胞miR-9718的表達(dá)情況;用M-CSF聯(lián)合RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，用Northern Blot及qRT-PCR測定miR-9718在RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式;用pSilencer4.1-CMV載體構(gòu)建miR-9718表達(dá)載體pre-miR-9718，并轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，建立miR-9718過表達(dá)細(xì)胞模型，加入R

3、ANKL及M-CSF誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，提取細(xì)胞總RNA用qRT-PCR法測定破骨細(xì)胞特異性標(biāo)記物TRAP及NFATc1的mRNA表達(dá)水平，并行TRAP染色觀察破骨細(xì)胞分化成熟情況;用2'甲氧基修飾的反義寡核苷酸anti-miR-9718轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建miR-9718表達(dá)抑制模型，qRT-PCR法測定破骨細(xì)胞分化過程中TRAP及NFATc1的mRNA表達(dá)水平，并行TRAP染色觀察破骨細(xì)胞分化成熟情況。
　　結(jié)果:

4、
　　(1)在小鼠原代破骨細(xì)胞中克隆了一個(gè)新的microRNA，提交miRBase數(shù)據(jù)庫注冊后命名為miR-9718;(2)發(fā)現(xiàn)miR-9718選擇性在破骨細(xì)胞及骨組織中高表達(dá)，而在小鼠其它組織和成骨細(xì)胞中幾乎不表達(dá);(3) RANKL及M-CSF誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中，miR-9718的表達(dá)逐漸增加;(4)用pSilencer4.1-CMV載體成功構(gòu)建了MiR-9718表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，

5、NorthernBlot證實(shí)RAW264.7細(xì)胞中miR-9718表達(dá)升高;(5)與對照相比，pre-miR-9718轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL及M-CSF誘導(dǎo)分化后，破骨細(xì)胞分化標(biāo)記物NFATc1和TRAP的mRNA表達(dá)水平升高，TRAP陽性多核巨細(xì)胞數(shù)目顯著增多;(6)與對照相比，anti-miR-9718轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化后，NFATc1和TRAPmRNA水平降低，TRAP陽性多核巨細(xì)胞明顯

6、減少。
　　結(jié)論:
　　在小鼠原代破骨細(xì)胞中鑒定了一個(gè)新的microRNA(miR-9718);在破骨細(xì)胞分化過程中miR-9718表達(dá)激活，支持破骨細(xì)胞的分化。
　　第二部分 miR-9718調(diào)控破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制研究
　　目的:
　　預(yù)測并驗(yàn)證miR-9718在破骨細(xì)胞分化中作用的靶基因，研究miR-9718調(diào)控RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制。
　　方法:
　　利用Rna2

7、2軟件預(yù)測miR-9718在破骨細(xì)胞分化中作用的靶基因，篩選出PIAS3為其作用的可能靶基因;將包含預(yù)測的miR-9718結(jié)合位點(diǎn)的PIAS3 CDS片段克隆到pGL3載體中構(gòu)建野生型PIAS3熒光素酶報(bào)告基因(WT-pGL3-PIAS3)，并用定點(diǎn)誘變試劑盒在miR-9718結(jié)合位點(diǎn)引入點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型PIAS3熒光素酶報(bào)告基因(MUT-pGL3-PIAS3)。將構(gòu)建兩種載體分別與pre-miR-9718或miR-C交叉轉(zhuǎn)染RAW2

8、64.7細(xì)胞，檢測熒光素酶活性。Pre-miR-9718單獨(dú)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，qRT-PCR和Westem Blot分別測定PIAS3 mRNA和蛋白水平變化。PCR擴(kuò)增小鼠PIAS3 CDS全長片段，另用定點(diǎn)誘變試劑盒在擴(kuò)增片段的miR-9718結(jié)合位點(diǎn)引入點(diǎn)突變（不導(dǎo)致編碼氨基酸的改變），與pCDNA3.1載體結(jié)合分別構(gòu)建野生型和突變型PIAS3表達(dá)載體。將構(gòu)建的兩種載體分別與pre-miR-9718或miR-C交叉轉(zhuǎn)染RA

9、W264.7細(xì)胞，用RANKL和M-CSF誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化后，qRT-PCR和Western Blot分別檢測TRAP、NFATc1mRNA水平和PIAS3蛋白水平。Pre-miR-9718和anti-miR-9718分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，RANKL和M-CSF誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，qRT-PCR檢測PIAS3 mRNA水平及Westem Blot檢測NFATc1、MITF、c-FOS、NF-κB和PIAS3蛋白表達(dá)水平。<

10、br>　　結(jié)果:
　　(1)Rna22預(yù)測PIAS3可能為miR-9718在破骨細(xì)胞分化中作用的靶基因;(2)構(gòu)建了野生型和突變型PIAS3熒光素酶報(bào)告基因，與轉(zhuǎn)染miR-C的對照組相比，pre-miR-9718與WT-pGL3-PIAS3共轉(zhuǎn)染組其熒光素酶活性受到抑制，而pre-miR-9718與MUT-pGL3-PIAS3共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無變化;(3)與轉(zhuǎn)染miR-C的對照組相比，在RAW264.7細(xì)胞中單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-m

11、iR-9718抑制了PIAS3蛋白表達(dá)水平，而對PIAS3 mRNA水平無明顯影響;(4) pre-miR-9718轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞并誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化后，NFATc1和TRAP mRNA水平顯著升高，pre-miR-9718與WT-PIAS3-CDS表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染也能使NFATc1和TRAP mRNA水平升高，而pre-miR-9718與MUT-PIAS3-CDS表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染不能增加NFATc1和TRAP mRNA水平;(5

12、) pre-miR-9718轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞并誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化后，PIAS3 mRNA水平無改變，而PIAS3蛋白表達(dá)減少，同時(shí)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子NFATc1、MITF、c-FOS和NF-κB表達(dá)上調(diào);而anti-miR-9718轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞并誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化后，PIAS3蛋白表達(dá)增加，NFATc1、MITF、c-FOS和NF-κB表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:miR-9718在轉(zhuǎn)錄后水平抑制PIAS3