紫杉醇對破骨細胞形成、分化及凋亡的影響.pdf

1、目的:利用RAW264.7小鼠巨噬細胞株（破骨前驅(qū)細胞株）培養(yǎng)系，研究紫杉醇對體外培養(yǎng)的破骨前驅(qū)細胞形成及分化的影響，并通過流式細胞技術(shù)，觀察紫杉醇是否通過調(diào)亡途徑抑制破骨前驅(qū)細胞的形成及分化。
　　 方法:選用RAW264.7小鼠巨噬細胞株（破骨前驅(qū)細胞株），進行破骨細胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察紫杉醇對破骨細胞形成及分化的影響，并通過流式細胞術(shù)分析紫杉醇是否對破骨細胞凋亡途徑有影響。
　　 1、細胞培養(yǎng)及藥物添加:

2、　　 1.1、細胞復(fù)蘇和培養(yǎng):從-70℃液氮罐中取凍存RAW264.7小鼠巨噬細胞株2管，迅速放入37℃恒溫水浴箱中快速復(fù)蘇（復(fù)蘇時間小于1分鐘），然后放至盛有10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液的離心管中離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分)，棄去上清液，再加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液10ml，吹打混勻后使形成單細胞懸液，然后移至培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育48-72小時，待培養(yǎng)瓶底細胞密度達到90％以上時，用1％胰酶

3、+EDTA將細胞重懸收集細胞于離心管內(nèi)離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），離心后棄去上清液，再加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液5ml，充分吹打混勻后使細胞重懸成單細胞懸液，用細胞計數(shù)板算出此時的細胞濃度，然后配制成4.5×104cells/ml目的濃度的細胞懸液，加入破骨細胞分化因子sRANKL50ng/ml、青霉素100單位/ml和鏈霉素100ug/ml。將細胞播種于96孔培養(yǎng)板（4行6列）中，每孔加入濃度為4.5×104cells/

4、ml的細胞懸液150ul。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5天。
　　 1.2、藥物的添加:將配好濃度的細胞播種在經(jīng)滅菌處理的96孔培養(yǎng)板中（共4行6列），將第一列作為本次實驗的對照組，不添加藥物。第二至五列依次加入紫杉醇，其濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L。每個濃度每列添加4孔。
　　 2、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:細胞培養(yǎng)至第5天后行TRAP染色（按試劑盒

5、說明操作），然后在倒置光鏡下觀察，計算TRAP染色陽性細胞數(shù)。觀察紫杉醇對破骨前驅(qū)細胞的抑制作用。
　　 3、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:
　　 3.1、細胞培養(yǎng):將復(fù)蘇后擬用于流式細胞檢測的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶底的細胞密度達到90％以上時，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，用1％胰酶+EDTA消化細胞，然后加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液8ml吹打混勻使細胞重懸，收集細胞至15ml離心管內(nèi)離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），然后棄去上清液

6、，再次加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液5ml，吹打混勻后形成單細胞懸液，用細胞計數(shù)板算出此時細胞原液濃度，然后再根據(jù)公式配制成目的濃度為4.5×104cells/ml的細胞懸液，并向配置好的細胞懸液中加入sRANKL50ng/ml、青霉素100單位/ml和鏈霉素100ug/ml。將加好細胞因子及雙抗的細胞懸液播種于24孔板的兩孔中，每孔加入500μl濃度為4.5×104cells/ml的細胞懸液。
　　 3.2、藥物的添加

7、:在24孔培養(yǎng)板第一孔為對照組，不添加任何藥物。第二孔選取行TRAP染色后對破骨前驅(qū)細胞形成抑制最明顯的紫杉醇濃度為添加藥物組（本實驗選用10-5mol/L）。
　　 3.3、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:細胞培養(yǎng)至第5天，用1％胰酶+EDTA消化細胞并將細胞重懸，然后分別收集到兩個離心管中，其中一管為對照組另一管為加藥組，放入離心機內(nèi)離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液。然后添加4℃保存的PBS緩沖液8ml，吹打混勻使細胞成單細胞

8、懸液，再次離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液。以300μl1x緩沖液將細胞重懸，每管加入Annexin(Ⅴ)5μl、Pi10μl，靜置30分鐘，再加入200μl1x緩沖液，立刻將細胞置于流式細胞儀依次檢測添加藥物后培養(yǎng)至第5天的細胞凋亡情況。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)分析:使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)處理采用非參數(shù)檢驗的方差分析和S-N-K檢驗。
　　 結(jié)果:
　　 1、破骨前驅(qū)細胞的形態(tài)學(xué)特征:細胞

9、培養(yǎng)第一天各組未見破骨細胞形成;第二、三天可見有少量破骨細胞形成;第五天時各組均可見到破骨前驅(qū)細胞。行TRAP染色后鏡下可見到大量染色陽性細胞，其形態(tài)學(xué)特征為:細胞體積較小，形態(tài)不規(guī)則，呈橢圓形、梭形、條索狀或不規(guī)則形:胞漿豐富，呈紫紅色，細胞核較小，數(shù)目多為1-2個，偶可見到3核者。
　　 2、紫杉醇對破骨細胞的形成和分化具有抑制作用。在同等條件下，藥物濃度越低則形成的破骨細胞數(shù)目越多。培養(yǎng)板第一列是對照組沒有添加藥物，形成破

10、骨細胞最多;第二列加入的濃度為10-5mol/L紫杉醇，形成的破骨細胞最少;第三、四、五、六列加入紫杉醇的濃度分別為10-6、10-7、10-8、10-9mol/L，形成破骨細胞的數(shù)目依次增多，與第一列相比統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05），說明紫杉醇對破骨細胞的形成和分化具有抑制作用。
　　 3、紫杉醇抑制破骨細胞的形成和分化是通過細胞凋亡途徑實現(xiàn)的。重復(fù)3次的流式細胞檢測結(jié)果顯示:對照組的散點圖大部分均分布在Q3象限，以正常