雙參通冠方促血管新生作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制研究.pdf

1、本課題采用雞胚絨毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane，CAM)，體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量、功能及冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型，觀察SSTG促血管生成作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)，探尋其作用機(jī)制，為其治療缺血性心臟病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題分為三個(gè)部分：
　　 一、雙參通冠方(SSTG)對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管新生的影響
　　 1.SSTG及有效組分含藥血清對(duì)雞胚絨毛尿

2、囊膜血管新生的影響
　　 目的：探討SSTG及單味藥提取物含藥血清對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響。方法：將無菌8日齡雞胚制備CAM模型，隨機(jī)分成5組：對(duì)照組，SSTG、丹參總酚酸、人參總皂苷及元胡總生物堿組。將蛋殼用75％乙醇消毒后，用鑷子小心開1.5cm×1.5cm的窗口，暴露CAM，將受試物品加到無菌的濾紙上，待風(fēng)干后，小心置于CAM上血管較少的部位，將窗口封上，放入孵箱，于37℃，60％相對(duì)濕度繼續(xù)孵育3天后，對(duì)CAM固定

3、后，采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果：SSGT(3.25±0.80)、丹參總酚酸(3.11±0.83)及人參總皂苷組(2.97±0.47)血管密度比明顯高于對(duì)照組(2.45±0.64)(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。結(jié)論：SSTG、丹參及人參可明顯促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管新生。
　　 2.丹參總酚酸及丹酚酸A、B對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響
　　 目的：探討丹參總酚酸及丹酚酸A、B對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響。

4、r>　　 方法：同前。結(jié)果：總酚酸100 mg/L(2.97±0.39)、300 mg/L(3.07±0.36)給藥組血管密度比明顯高于對(duì)照組(2.47±0.35)(P<0.05，P<0.05)；丹酚酸A5.56mg/L(4.42±1.16)、16.67 mg/L(5.51±1.15)、50 mg/L(4.60±0.71)給藥組血管密度比明顯高于對(duì)照組(3.07±0.85)(P<0.05，P<0.001，P<0.01)；丹酚酸B50m

5、g/L(2.18±0.31)、150 mg/L(2.43±0.32)給藥組血管密度比明顯高于對(duì)照組(1.86±0.30)(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：丹參總酚酸、丹酚酸A及丹酚酸B可明顯促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管新生。
　　 二、丹參總酚酸及丹酚酸A對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)功能的影響
　　 1.內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：建立新生鼠脾臟來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法：密發(fā)梯度離心法分離

6、SD新生鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，EGM—2完全培養(yǎng)基貼壁法，37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。細(xì)胞長至近融合時(shí)傳代，分別于第9天進(jìn)行細(xì)胞鑒定。內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)的CD34和VEGFR—2染色；內(nèi)吞DiI標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(DiI—acLDL)和結(jié)合FITC標(biāo)記的荊豆凝集素—1(FITC—UEA—1)的激光共聚焦顯微鏡觀察及超微結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：脾臟單個(gè)核細(xì)胞接種24h后部分細(xì)胞開始貼壁、變大

7、，倒置顯微鏡下貼壁細(xì)胞透亮度增強(qiáng)，并逐漸伸出偽足樣突起，呈小桿狀或梭形。培養(yǎng)第3天貼壁細(xì)胞開始增殖，呈“集落”樣生長，外周梭形細(xì)胞較多；共聚焦顯微鏡觀察顯示細(xì)胞DiI—acLDL和FITC—UEA—1呈紅綠免疫雙熒光陽性；培養(yǎng)第9天細(xì)胞VEGFR—2和CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性；電鏡下觀察可見內(nèi)皮細(xì)胞特異性的W—P小體存在；功能鑒定顯示EPCs體外培養(yǎng)形成血管結(jié)構(gòu)。結(jié)論：新生鼠的脾臟單個(gè)核細(xì)胞可以培養(yǎng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞并能夠形成血管結(jié)構(gòu)。

8、
　　 2.丹參總酚酸對(duì)正常及H2O2損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響
　　 目的：探討丹參總酚酸對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響以及對(duì)H2O2損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。方法：密度梯度離心法獲取新生鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞長至融合狀態(tài)后，收集貼壁細(xì)胞并加入丹參總酚酸(0.3，3和30mg/L)干預(yù)24h，分別觀察其對(duì)EPCs的增殖、遷移、粘附、體外成管能力的影響。同時(shí)，應(yīng)用200μmol/L H2O2對(duì)EPCs進(jìn)行損傷，觀察丹參總酚酸的保護(hù)

9、作用。結(jié)果：丹參總酚酸促進(jìn)EPC擴(kuò)增，3及30mg/L丹參總酚酸作用24 h對(duì)EPCs數(shù)量有顯著性影響(P<0.05，P<0.05)，同時(shí)也顯著改善了EPCs的粘附、遷移及體外成管能力。對(duì)200μmol/L H2O2損傷EPCs的粘附及成管能力有明顯的改善作用。結(jié)論：丹參總酚酸可增加EPCs數(shù)量并改善其功能并對(duì)H2O2損傷的EPCs的功能有改善作用。
　　 3.丹酚酸A對(duì)正常及H2O2損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及初步機(jī)制研究

10、>　　 目的：探討丹酚酸A對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響以及對(duì)H2O2損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。方法：密度梯度離心法獲取新生鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞長至融合狀態(tài)后，收集貼壁細(xì)胞并加入丹酚酸A(10—9，10—8和10—7mol/L)干預(yù)24h，分別脫察其對(duì)EPCs的增殖、遷移、體外成管能力的影響，并采用ELISA試劑盒檢測加入丹酚酸A對(duì)培養(yǎng)上清中SDF—1及MMP—9含量的影響，采用NO試劑盒檢測細(xì)胞上清中NO量的變化。同時(shí)，應(yīng)用200μmol

11、/L H2O2對(duì)EPCs進(jìn)行損傷，觀察丹酚酸A的保護(hù)作用。結(jié)果：丹酚酸A促進(jìn)EPCs擴(kuò)增，10—9，10—8和10—7mol/L酚酸A作用24 h對(duì)EPCs數(shù)量有顯著性影響(P<0.05，P<0.05)，同時(shí)也顯著改善了EPCs的遷移、成管能力；顯著增加條件培養(yǎng)上清中SDF—1、MMP—9及NO的量。對(duì)200μmol/L H2O2損傷EPCs的粘附及成管能力有明顯的改善作用。結(jié)論：丹酚酸A可增加EPC數(shù)量并改善其功能，其機(jī)制可能與增加S

12、DF—1、MMP—9表達(dá)及NO的量有關(guān)，并對(duì)H2O2損傷的EPCs的功能有改善作用。
　　 三、丹酚酸A對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠血管新生的影響及機(jī)制研究
　　 目的：探討丹酚酸A對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠血管新生的影響及其機(jī)制探討。方法：結(jié)扎Wistar大鼠冠狀動(dòng)脈左旋降支建立心肌缺血大鼠模型，隨機(jī)分為模型組，丹酚酸A2.5、5、10mg/kg給藥組，陽性對(duì)照藥組及假手術(shù)組。于手術(shù)后第二天尾靜脈注射給藥，每天1次，7天后做以下實(shí)驗(yàn)：1)檢測心

13、肌缺血面積(NBT染色法)；2)HE染色觀察缺血心肌的病理改變；3)免疫組化方法檢測心肌梗死周圍區(qū)VEGF/VEFGR—2的表達(dá)以及CD34標(biāo)記的微血管密度；4)ELISA法檢測血清中SDF—1及MMP—9表達(dá)量的變化。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血心肌部位心肌細(xì)胞明顯損傷(P<0.05)，丹酚酸A10、5劑量組梗死面積/心臟面積比值明顯降低(P<0.01，P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組梗死周圍區(qū)CD34+細(xì)胞(P<0.0

14、5)明顯增多，VEGF(P<0.001)和VEGFR—2(P<0.001)表達(dá)明顯增強(qiáng)，與模型組比較，丹酚酸A10、5、2.5mg/kg劑量組梗死周圍區(qū)微血管密度明顯增多(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，丹酚酸A10、5mg/kg梗死周圍區(qū)VEGF(P<0.001，P<0.05)和VEGFR—2(P<0.001，P<0.001)表達(dá)顯著升高；與假手術(shù)組比較，模型組SDF—1(P<0.05)及MMP—9(P<0.05)表

15、達(dá)上升；與模型組比較，丹酚酸A10、5、2.5mg/kg劑吊組顯著促進(jìn)SDF—1(P<0.01，P<0.05)及MMP—9(P<0.001，P<0.001，P<0.05)的表達(dá)。結(jié)論：丹酚酸A可降低心肌缺血大鼠梗死面積，其可能機(jī)制是通過上調(diào)VEGF和VEGFR—2及增加SDF—1、MMP—9的表達(dá)促進(jìn)了內(nèi)源性的血管新生。
　　 綜上所述，首先CAM模型的結(jié)果顯示：雙參通冠方具有促進(jìn)血管新生的作用，其有效組分丹參總酚酸及人參總皂苷

16、也具有促CAM血管新生的作用，我們選擇了丹參作為繼續(xù)研究的對(duì)象，結(jié)果顯示丹酚酸A比丹酚酸B有更好的促進(jìn)CAM血管新生的作用；丹酚酸A促進(jìn)體外培養(yǎng)EPCs的數(shù)量的增加及功能的改善；整體心肌缺血模型的結(jié)果顯示，丹酚酸A有明顯降低缺血心肌梗死面積，促進(jìn)缺血后心肌MVD增加的作用，其促進(jìn)血管新生的可能作用機(jī)理為通過上調(diào)VEGF和VEGFR—2及增加SDF—1、MMP—9的表達(dá)促進(jìn)EPCs的動(dòng)員、分化與歸巢，促進(jìn)了內(nèi)源性的血管新生。因此，我們得出