TRIM29逆轉(zhuǎn)P53突變型結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 pIRES2-ZsGreen1-TRIM29載體構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒表達(dá)載體
　　方法:以pDONR223-TRIM29為基因模板，PCR擴(kuò)增TRIM29CDS區(qū)片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收TRIM29條帶。用BglⅡ、EcoRⅠ將回收的TRIM29的PCR片段及目的載體pIRES2-ZsGreen1雙酶切，然后進(jìn)行連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5

2、α中進(jìn)行擴(kuò)增，挑選kan+陽(yáng)性克隆菌落，進(jìn)行小規(guī)模質(zhì)粒提取。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及DNA測(cè)序鑒定。
　　結(jié)果:1、將TRIM29的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，條帶大小在1.8K左右，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。
　　2、用BglⅡ、EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，切出約1.8K左右的TRIM29片段帶和約5.3kb左右的載體條帶。結(jié)果與預(yù)期一致。
　　3、將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序所得的序列和TRIM29基因片段序列進(jìn)行比對(duì)，顯示

3、構(gòu)建序列與預(yù)期序列完全一致，pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建pIRES2-ZsGreen1-TRIM29表達(dá)質(zhì)粒。
　　第二部分 TRIM29大幅提高P53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HT29對(duì)奧沙利鉑的敏感性
　　目的:探索在不同p53狀態(tài)下，TRIM29對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑敏感性的影響
　　方法:選取P53野生型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和P53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HT29（

4、R273H附錄1）進(jìn)行對(duì)照研究。利用MTT方法分別測(cè)定轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒前后，兩株細(xì)胞生長(zhǎng)速度的變化和奧沙利鉑IC50的變化。
　　結(jié)果:1、轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒后，HCT116和HT29兩株細(xì)胞TRIM29的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均上升，提示轉(zhuǎn)染成功。
　　2、轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒后，HCT116從第4天開(kāi)始生長(zhǎng)明顯加快，到

5、第7天時(shí)，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞數(shù)約為親代組細(xì)胞數(shù)的1.4倍。而HT29從第3天起生長(zhǎng)速度比親代細(xì)胞減慢，第7天時(shí)，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞數(shù)約為親代組細(xì)胞數(shù)的73％。
　　3、轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒后，HCT116的奧沙利鉑IC50從34.89umol/L提高到47.26umol/L，耐藥指數(shù)1.35，輕度降低了HCT116對(duì)奧沙利鉑的敏感性;而HT29的奧沙利鉑IC50從11.54umol/L降至0.98umol/L，

6、耐藥指數(shù)0.08，顯著提高了HT29對(duì)奧沙利鉑的敏感性。
　　結(jié)論:1、在結(jié)腸癌中，TRIM29對(duì)表達(dá)野生型P53的細(xì)胞，表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)作用;而對(duì)表達(dá)突變型P53的細(xì)胞，表現(xiàn)為抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
　　2、在野生型P53結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中，TRIM29阻斷P53功能能夠增加細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥，但不顯著。提示野生型P53與奧沙利鉑敏感性輕度相關(guān)。
　　3、在突變型P53結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中，TRIM29能夠大

7、幅提高HT29對(duì)奧沙利鉑的敏感性。提示TRIM29可能通過(guò)結(jié)合組阻斷突變型P53功能來(lái)提高HT29對(duì)于奧沙利鉑的敏感性，突變型P53與奧沙利鉑耐藥高度相關(guān)。
　　第三部分 HT29-OX耐藥細(xì)胞模型的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建P53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HT29耐奧沙利鉑模型
　　方法:利用低濃度持續(xù)培養(yǎng)法構(gòu)建HT29結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞模型。首先在奧沙利鉑濃度為4umol/L(1/3 IC50)時(shí)培養(yǎng)HT29細(xì)胞2-4個(gè)星期，直

8、到細(xì)胞出現(xiàn)成倍數(shù)增長(zhǎng)時(shí)，再在4umol/L繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)星期，傳代。將奧沙利鉑濃度提高至6umol/L。按此循環(huán)，將奧沙利鉑的濃度逐步提高直至12umol/L(4umol/L-6umom/L-8umol/L-10umol/L-12umol/L)。
　　結(jié)果:1、成功獲得能夠在奧沙利鉑濃度為4umol/L，8umol/L和12umol/L時(shí)，穩(wěn)定生長(zhǎng)的三株耐藥細(xì)胞模型，分別命名為HT29-OX-4umol/L，HT29-OX-8umo

9、l/L，HT29-OX-12umol/L。
　　2、三株耐藥細(xì)胞模型奧沙利鉑IC50分別為74.42umol/L，136.50umol/L188.90umol/L，耐藥指數(shù)分別為6.47，11.90，16.37。
　　3、隨著耐藥濃度的增加，三株耐藥細(xì)胞中MDR1的表達(dá)逐漸增加（其中HT29-OX-12umol/LmRNA水平上升至親代的4.3倍，蛋白質(zhì)水平上升至親代的2倍）。
　　結(jié)論:成功建立HT29-OX-4um

10、ol/L，HT29-OX-8umol/L，HT29-OX-12umol/L三株耐藥細(xì)胞模型。為下一步研究TRIM29在突變型P53結(jié)腸癌耐奧沙利鉑中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　第四部分 TRIM29逆轉(zhuǎn)HT29-OX耐藥細(xì)胞模型對(duì)奧沙利鉑的耐藥及其機(jī)制探討
　　目的:進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM29能否逆轉(zhuǎn)HT29-OX耐藥細(xì)胞模型對(duì)奧沙利鉑的耐藥及其可能的機(jī)制。
　　方法:利用MTT方法測(cè)定轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen

11、1-TRIM29質(zhì)粒前后，HT29-OX-12umol/L細(xì)胞奧沙利鉑IC50的變化。利用免疫共沉淀的方法檢測(cè)P53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HT29內(nèi)TRIM29和突變型P53蛋白之間的相互作用。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和westernblot方法，檢測(cè)隨耐藥濃度的增加，三株耐藥細(xì)胞模型中TRIM29，P53的表達(dá)變化情況。檢測(cè)HT29-OX-12umol/L細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒后，P53和MDR1表達(dá)的變化。

12、
　　結(jié)果:1、HT29-OX-12umol/L耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒后，奧沙利鉑IC50從188.90umol/L下降至22.59umol/L，耐藥株指數(shù)從16.37下降至1.96。成功逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥模型對(duì)奧沙利鉑的耐藥。
　　2、在P53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中TRIM29和突變型P53蛋白相互結(jié)合。
　　3、隨著耐藥濃度的增加，TRIM29表達(dá)逐漸下降（其中HT29-OX-

13、12umol/L mRNA水平下降至親代的23％，蛋白質(zhì)水平下降至親代的41％），P53表達(dá)逐漸增高（其中HT29-OX-12umol/LmRNA水平上升至親代的5.1倍，蛋白質(zhì)水平上升至親代的1.8倍）。
　　4、轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29質(zhì)粒后，在HT29-OX-12umol/L耐藥細(xì)胞中，MDR1表達(dá)明顯下降（MDR1 mRNA表達(dá)水平下降至耐藥細(xì)胞的24％，蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降至耐藥細(xì)胞的43％）;P5