CYP3A4基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合環(huán)磷酰胺的抗腫瘤效應研究.pdf

1、目的:從人肝細胞中克隆細胞色素P4503A4（CYP3A4)基因，構(gòu)建含CYP3A4的真核表達載體。分離、培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，并鑒定其正確性，體外檢測BMSCs向腫瘤細胞的趨化遷移特性。將含CYP3A4的真核表達載體轉(zhuǎn)染BMSCs，檢測轉(zhuǎn)基因BMSCs聯(lián)合化療前藥環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CPA)對人慢性髓細胞白血病K

2、562細胞株的生長抑制作用，為體內(nèi)實驗及臨床應用以BMSCs為載體、CYP3A4為外源酶基因靶向治療腫瘤的“基因介導的酶前藥治療(Gene Directed EnzymeProdrug Therapy，GDEPT)”策略提供實驗依據(jù)。
　　方法:采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)從人肝細胞中克隆CYP3A4基因CDS區(qū)全長序列，構(gòu)

3、建重組真核表達載體pcDNA3.1/myc-His A(+)-CYP3A4。用Percoll細胞分離液經(jīng)密度梯度離心法從人骨髓血中分離BMSCs，傳代培養(yǎng)后，分別從細胞形態(tài)、細胞表面抗原、成脂肪誘導分化、標志基因RT-PCR檢測等方面進行鑒定。用Transwell小室檢測BMSCs向腫瘤細胞的趨化遷移特性。脂質(zhì)體法將構(gòu)建的重組載體分別導入BMSCs和K562細胞中，分別用RT-PCR和Western-blot檢測CYP3A4基因的表達評

4、估轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)基因BMSCs與野生型K562細胞共培養(yǎng)，MTT法檢測CYP3A4轉(zhuǎn)染BMSCs聯(lián)合CPA的細胞毒作用和旁觀者效應及分別加入酶誘導劑(地塞米松，Dexamethasone，DEX)和抑制劑（酮康唑，Ketoconazole，KET）后對該細胞毒作用的影響。
　　結(jié)果:成功克隆人CYP3A4基因并構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1/myc-His A(+)-CYP3A4。成功分離、培養(yǎng)的人BMSCs，經(jīng)細胞形態(tài)觀察、

5、流式細胞儀檢測細胞表面抗原、成脂肪誘導分化和神經(jīng)節(jié)苷脂GD2基因mRNA水平表達檢測鑒定后符合BMSCs特性。利用Transwell小室證明了BMSCs可通過聚碳酸酯膜分別向下室內(nèi)的K562和人神經(jīng)母細胞瘤SHSY-5Y細胞遷移。RT-PCR和Western-blot分別檢測到轉(zhuǎn)基因細胞中CYP3A4（高）表達。MTT法示酶前藥CPA呈濃度依賴性抑制各實驗組細胞生長且對轉(zhuǎn)基因組細胞的抑制作用較轉(zhuǎn)空載體組明顯增強，同時共培養(yǎng)組有明顯的旁觀

6、者效應（轉(zhuǎn)基因K562細胞IC50為1.09±0.08mmol/L，轉(zhuǎn)空載體K562細胞IC50為4.66±0.33 mmol/L，P＜0.01;轉(zhuǎn)基因BMSCs IC50為7.11±0.23 mmol/L，轉(zhuǎn)空載體BMSCs IC50為9.71±0.53mmol/L，P＜0.01;轉(zhuǎn)基因BMSCs與野生型K562細胞共培養(yǎng)組，K562細胞IC50為1.35±0.30 mmol/L，轉(zhuǎn)空載體BMSCs與野生型K562細胞共培養(yǎng)組，K56

7、2細胞IC50為4.73±0.30 mmol/L，P＜0.01）;以轉(zhuǎn)基因BMSCs與野生型K562細胞共培養(yǎng)組作對照，CPA對酶誘導劑組細胞抑制作用明顯增強（IC50為0.48±0.17 mmol/L，P＜0.05），對酶抑制劑組細胞抑制作用明顯減弱（IC50為3.58±0.38 mmol/L，P＜0.01）;可選1 mmol/L CPA濃度作人BMSCs的相對安全濃度。
　　結(jié)論:人BMSCs體外具有向腫瘤細胞趨化遷移的特性。