四君子湯 柴疏四君湯 柴胡疏肝散作用于脾虛證大鼠模型的生物效應比較.pdf

1、“方證相關”是中醫(yī)辨證論治和方劑學中的重要邏輯命題。方劑的功用不僅與方藥配伍有關，還與其所作用的證之間具有一定的適配性，即方劑效用大小在相當程度上取決于所作用對象的病機與其方藥配伍關系之間的針對性，方與證之間存在有關聯程度大小的問題。但到目前為止，還沒有人能從實證意義上為“方證相關”提供系統(tǒng)的科學證據?；谏鲜霰尘埃疚囊栽趦群暇哂幸欢P聯的方劑和證候為切入點，運用關聯排他和異方同證的研究方法較為系統(tǒng)地探查了中醫(yī)“方證相關”命題的客觀

2、真實性。 本研究首先依據中醫(yī)關于脾虛證的病因病機學說、臨床表現和其涉及到現代相關疾病的病理生理的變化特點，采用復合病因造模法復制脾虛證大鼠模型，通過神經-內分泌-免疫系統(tǒng)中的多指標觀察，以獲得模型的中醫(yī)證候及部分生物學特點；在此基礎上，比較觀察具有健脾、疏肝和疏肝健脾功用的四君子湯、柴胡疏肝散和柴疏四君湯三方對該模型的作用異同，探討同一脾虛證條件下三方效用的差異，以獲得三方與脾虛證之間可能存在的關聯性及其關聯性現代內涵。之后，觀

3、察了四君子湯對脾虛證模型甲狀腺軸、血液流變學、能量代謝等其它方面的效應，了解方證相應條件下的四君子湯的作用效應譜其可能涉及到的生物學基礎。最后，運用基因芯片技術探查了脾虛證模型及四君子湯對模型作用的全基因表達，進一步分析探討脾虛模型和四君子湯作用的分子機制。 全文分為文獻綜述和實驗研究兩大部分。文獻綜述部分主要對脾虛證動物模型復制研究進展及存在問題、四君子湯的實驗研究與臨床應用、基因芯片技術在中醫(yī)藥領域中的研究與應用現況等三個方

4、面進行綜述。實驗研究部分主要包括脾虛證大鼠模型的復制及評價；四君子湯、柴胡疏肝散及柴疏四君湯對脾虛模型的影響；四君子湯對模型中甲狀腺軸、能量代謝、血液流變學的調節(jié)作用；脾虛證大鼠模型相關基因表達譜及四君子湯對其影響的初步探查四方面。 研究一 脾虛證大鼠模型的建立 方法：將大鼠隨機分為對照組和脾虛模型組，每組40只。模型組大鼠采用過度勞倦加飲食失節(jié)的方法。模型大鼠每日下午2：00置于盛有溫水的塑料鋼化桶中游泳10min：隔

5、日喂食(隔同禁食，隔同足量給食)，連續(xù)3w。于造模第22d開始，停止上述造模因素，自然飼養(yǎng)條件下觀察1w。分別于造模的第1、2、3、4w取材，用間苯三酚法測尿D-木糖排泄率，用高效液相色譜一電化學法檢測單胺神經遞質，用試劑盒放免法檢測血清GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα；血漿MTL、SS、VIP、NPY、SP、β-EP、ACTH、CORT：下丘腦CRH的含量。 結論：該模型大鼠表現出部分類似脾虛證的癥狀，存在小腸

6、吸收功能障礙、胃腸功能、免疫系統(tǒng)、神經遞質、HPA軸功能的紊亂。結果提示本模型符合中醫(yī)脾虛證的表現，且存在胃腸功能紊亂和神經-內分泌-免疫網絡中多環(huán)節(jié)的調節(jié)障礙。 研究二 四君子湯、柴疏四君湯和柴胡疏肝散對脾虛證大鼠模型的作用 方法：將大鼠隨機分為2組：對照組(20只)，模型組(50只)，模型組大鼠按上述制模方法處理3w，于造模第3w木分別從對照組和模型組隨機各取大鼠10只取材。第22d停止造模，模型組大鼠隨機分成脾虛模

7、型(model)、柴胡疏肝散(CHSGS)，四君子湯(SJZT)、柴疏四君湯(CSSJT)四組，每組10只。中藥三組分別按1mL/100g體重給予柴胡疏肝散、四君子湯、柴疏四君湯灌胃，連續(xù)7d，每日1次。模型組和對照組分別給予等量蒸餾水。4w末剖殺取材，用上述方法測定相關指標，并用MTT法測定脾T淋巴細胞增殖轉化功能。 結論：脾虛模型大鼠表現有胃腸功能、免疫系統(tǒng)、神經遞質、HPA軸等方面的異常變化；被觀察的三方均具有不同程度的調

8、節(jié)作用，其中四君子湯能明顯降低模型大鼠血漿MTL、海馬DA；升高模型大鼠血清GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα、海馬5-HT、NE、血漿SS、VIP、ACTH、CORT及脾T淋巴細胞增殖轉化功能。柴胡疏肝散能明顯降低模型大鼠血漿VIP、血清IL-2、海馬DA及脾T淋巴細胞增殖轉化功能；能明顯升高模型大鼠海馬NE、血漿CORT。柴疏四君湯能明顯升高模型大鼠血清GAS、IL-1β、血漿SS、ACTH、CORT、海馬NE；能明顯

9、降低模型大鼠海馬DA及脾T淋巴細胞增殖轉化功能。結果提示，四君子湯在調節(jié)脾虛模型胃腸功能、神經-內分泌-免疫網絡異常改變方面優(yōu)于柴胡疏肝散、柴疏四君湯：較之于柴胡疏肝散和柴疏四君湯二方，四君子湯與中醫(yī)脾虛證之間具有更大的關聯性。 研究三 四君子湯對脾虛證大鼠模型的其他作用 方法：將大鼠隨機分為對照組(20只)和模型組(30只)。模型組按上述方法制模，于造模第3w末分別從對照組和模型組隨機各取大鼠10只取材，第4w停止造模

10、，模型組大 鼠隨機分成脾虛模型組(model)、四君子湯(SJZT)兩組，每組各10只。四君子湯組按1mL/100g體重給予灌胃，連續(xù)7d，每日1次。脾虛模型組和對照組分別給予等量蒸餾水。于4w末剖殺取材，放免法檢測血清TSH、T<,3>、T<,1>和血漿TXB<,2>、6-keto-PGF<,1α>；高效液相法檢測肝組織能荷；全自動生化分析儀檢測血清LDL、CK、P-AMY；比色法檢測肝組織Na<'+>-K<'+>-ATPas

11、e、Ca<'2+>-Mg<'2+>-ATPase、Ca<'2+>-ATPase；血液粘度測試儀測定血流變。 結論：脾虛證模型存在甲狀腺功能、能量代謝、血液流變學及TXB<,2>/6-Keto-PGF<,1a>的異常改變；四君子湯可明顯升高脾虛模型組大鼠血清TSH、T<,3>、T<,4>、LDH、肝組織EC、Ca<'2+>-Mg<'2+>-ATPase、Ca<'+>-ATPase活力及TXB<,2>/6-keto-PGF<,1a>

12、，明顯降低模型大鼠血清P-AMY、肝組織AMP、全血粘度、還原粘度、血漿TXB<,2>、6-keto-PGF<,1a>。結果表明，四君子對脾虛模型大鼠出現的甲狀腺功能、酶學、血液流變學異常具有一定的調節(jié)作用。 研究四 脾虛證大鼠模型相關基因表達及四君子湯對其的影響 方法：將大鼠隨機分為對照組(20只)和模型組(30只)。模型組按上述方法制模，于造模第3w術分別從對照組和模型組隨機各取大鼠10只在無菌條件下取脾臟。第4w停

13、止造模，造模組動物隨機分成脾虛模型(model)、四君子湯(SJZT)兩組，每組各10只。四君子湯組按1mL/100g體重給予四君子湯灌胃，連續(xù)7d，每日1次。模型組和對照組分別給予等量蒸餾水。同前法于第4w術在無菌條件下剖取脾臟，進行脾臟RNA的提取、樣品RNA熒光標記、雜交與清洗、芯片掃描、圖像采集與數據分析；主要利用 http：//www．biorag．org/中的功能基因庫對獲得的差異基因進行功能查詢。 結論：脾

14、虛證模型存在部分基因的異常表達，涉及細胞因子調節(jié)、細胞內信號轉導、酶催化活性、能量代謝、蛋白質合成等多個方面；四君子湯對脾虛的基因表達具有廣泛作用，其中涉及到對MAPK信號通路、甘油磷脂代謝、G蛋白偶聯受體信號系統(tǒng)、JAK-STAT信號通路等多個方面。結果提示，多個基因的異常表達可能是中醫(yī)脾虛證的分子基礎，而脾虛證治方則對包括與脾虛證相關的基因在內的多個基因發(fā)揮復雜的調節(jié)作用。 綜上，采用游泳勞倦和飲食失節(jié)復合法復制出的脾虛證模

15、型，表現出少動、乏力、食欲減退、消瘦、大便稀溏等脾虛證的類似癥狀，伴有胃腸功能、神經-內分泌-免疫、血液流變學、能量代謝等多系統(tǒng)的功能紊亂，并存在部分基因的異常表達。結果提示，中醫(yī)脾虛證可能是一個以多組基因表達異常為基礎、涉及神經-內分泌-免疫網絡中多環(huán)節(jié)調節(jié)障礙的綜合征。四君子湯、柴胡疏肝散和柴疏四君湯三方對脾虛證模型的神經-內分泌-免疫方面有一定的調節(jié)作用，其中四君子湯對脾虛模型胃腸激素、免疫因子、神經遞質方面均有很好的調節(jié)作用；柴

16、胡疏肝散對神經遞質有調節(jié)作用，能使降低的VIP、IL-2、脾T淋巴細胞增殖轉化功能再度降低；柴疏四君湯主要對神經遞質、HPA軸有調節(jié)作用。四君子湯在調節(jié)脾虛模型神經-內分泌-免疫、胃腸功能方面明顯優(yōu)于柴胡疏肝散和柴疏四君湯。對三方治療效應譜和作用強度的綜合評價表明，四君子湯對脾虛模型的療效最好，柴疏四君湯次之，柴胡疏肝散較差，四君子湯與脾虛證的關聯性最大。四君子湯還對模型中存在的甲狀腺功能、血液流變學、能量代謝等方面的異常有一定的改善作