川芎嗪上調(diào)膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體水通道蛋白8表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　膿毒癥是感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，是ICU患者的常見病癥，病死率較高，受到急危重癥醫(yī)學(xué)專家的極大關(guān)注。有研究認(rèn)為，線粒體功能障礙和由此引起的細(xì)胞能量代謝衰竭是膿毒癥引起多器官功能衰竭的主要病理機(jī)制之一;研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的水通道蛋白8（aquaporin-8，AQP8）對調(diào)節(jié)線粒體膜的水轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要的作用，在生理狀態(tài)下，AQP8對調(diào)節(jié)線粒體容量的改變和代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要;同時(shí)在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子的作用下，

2、AQP8還參與了線粒體滲透性腫脹的病理過程。線粒體功能障礙和全身性炎癥反應(yīng)的程度都與膿毒癥病情的嚴(yán)重性及膿毒癥患者的預(yù)后密切相關(guān);近年來，膿毒癥治療靶點(diǎn)方面的臨床研究是工作重點(diǎn)之一。以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)線粒體損傷的臨床治療為目標(biāo)的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，盡管在干預(yù)治療時(shí)機(jī)的選擇和在治療的效果與安全性之間的評估和如何避免該治療方法是否會(huì)給患者帶來其它附加傷害等方面研究結(jié)果仍然飽受爭議。
　　川芎嗪的有效成分是四甲基吡嗪(tetramethy

3、lpyrazine，TMP)，它是中草藥川芎的有效成分之一，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體內(nèi)的研究證明TMP對膿毒癥引起的急性肝損傷具有保護(hù)作用，其保肝作用的機(jī)制可能是通過TMP具有的滅活氧自由基、抗氧化作用可阻止脂質(zhì)過氧化、保護(hù)具有抗氧化作用的酶如谷胱甘肽過氧化酶和谷胱甘肽還原酶等環(huán)節(jié)而起作用的;研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪對肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有保護(hù)作用。在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis faetor-α，TNF-α)介導(dǎo)的膿毒癥實(shí)驗(yàn)

4、動(dòng)物模型中，肝細(xì)胞AQP8的表達(dá)可能通過其轉(zhuǎn)錄后抑制的機(jī)制而被下調(diào)，導(dǎo)致AQP8介導(dǎo)的水向線粒體外的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，線粒體體積的快速膨脹，線粒體破裂;這種肝細(xì)胞線粒體腫脹和破裂的現(xiàn)象被認(rèn)為是肝細(xì)胞在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的刺激下，激活機(jī)體氧化磷酸化過度活躍的結(jié)果。本研究的目的是證實(shí)川芎嗪對膿毒癥大鼠的肝細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)完整性具有保護(hù)作用，這個(gè)作用是通過上調(diào)膿毒癥狀態(tài)下肝細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的AQP8蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：
　　48

5、只SD大鼠被隨機(jī)分為四組，每組12只。使用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligationand puncture, CLP)的方法制備膿毒癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對照組接受假手術(shù)處理;膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅進(jìn)行CLP手術(shù);治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在完成CLP手術(shù)后，立即從尾靜脈注射鹽酸川芎嗪注射液，劑量為60 mg/kg;預(yù)防組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在從尾靜脈注射60 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液7天后，進(jìn)行CLP手術(shù)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)觀察大鼠術(shù)后的存活時(shí)間;正式實(shí)驗(yàn)時(shí)觀察大鼠手術(shù)結(jié)

6、束至出現(xiàn)明顯膿毒癥癥狀所需的時(shí)間，在術(shù)后10小時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在苯巴比妥腹腔注射麻醉后從腹主動(dòng)脈抽取2ml血液檢測TNF-α，然后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟被快速取出置于緩沖液冰水中。
　　取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟制備50nm厚度的電鏡切片，使用4％的醋酸鈾酰和0.5％的醋酸鉛染色后，觀察肝細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu);使用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單個(gè)肝細(xì)胞切面的線粒體數(shù)、單位面積肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)和單位體積肝細(xì)胞內(nèi)線粒體

7、容積。分離肝細(xì)胞線粒體，制備肝細(xì)胞線粒體的裂解液，使用Western blot技術(shù)檢測肝細(xì)胞線粒體膜AQP8蛋白的相對表達(dá)量;并分離線粒體總的RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)技術(shù)檢測肝細(xì)胞線粒體AQP8 mRNA的相對表達(dá)量，所有樣本的AQP8 mRNA定量使用β-actin作為內(nèi)參，資料分析使用iCycler IQ Real-timePC

8、R檢測系統(tǒng)軟件進(jìn)行。
　　使用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度(meanfluorescence intensity，MFI)，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，熒光信號(hào)強(qiáng)度使用FACS Diva軟件進(jìn)行記錄并分析;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測大鼠被處死前的血清TNF-α濃度。
　　使用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)分析。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活時(shí)間、實(shí)驗(yàn)結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥表現(xiàn)的時(shí)間、每個(gè)橫切面的肝細(xì)胞線粒體總數(shù)、肝細(xì)胞不同區(qū)域單位面積內(nèi)線粒體數(shù)、單位體積內(nèi)的線粒體容積、AQP8 mRNA表達(dá)、AQP8蛋白表達(dá)、羅丹明123的熒光強(qiáng)度和TNF-α使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;AQP8蛋白和AQP8 mRNA的表達(dá)與羅丹明123的熒光強(qiáng)度及TNF-α間的相關(guān)性使用直線相關(guān)性檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.手術(shù)時(shí)間、手術(shù)結(jié)束至出現(xiàn)

10、膿毒癥癥狀的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活時(shí)間比較膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的手術(shù)結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時(shí)間較治療組和預(yù)防組要短（P＜0.01），即TMP可以延緩實(shí)驗(yàn)大鼠膿毒癥發(fā)作的時(shí)間;預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察治療組和預(yù)防組的大鼠存活時(shí)間較膿毒癥組大鼠為長（P＜0.01）;治療組和預(yù)防組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較出現(xiàn)膿毒癥表現(xiàn)的時(shí)間和存活時(shí)間均無顯著差異。對照組大鼠手術(shù)時(shí)間較另三組明顯縮短（P＜0.01），CLP手術(shù)時(shí)間在另3組間無顯著性差異（P＞0.05）。
　　2.線粒體

11、結(jié)構(gòu)的變化膿毒癥組大鼠肝細(xì)胞線粒體的體積增大，嵴腫脹明顯、空泡樣變，甚至線粒體外膜破裂，發(fā)生脂肪變性。在治療組和預(yù)防組，線粒體顯著腫脹、空泡化改變，基質(zhì)濃縮，脊變寬，胞漿內(nèi)可見脂肪滴等變化均較膿毒癥組減輕，且兩組間并無顯著性差異。和對照組比較，其它3組單個(gè)肝細(xì)胞切面的線粒體總數(shù)均減少（P＜0.01），但治療組和預(yù)防組均多于膿毒癥組(P＜0.01);膿毒癥組的不同區(qū)域的平均線粒體數(shù)也較少（P＜0.01），但單位體積內(nèi)的線粒體容量并無顯著性

12、差異(P＞0.05)。
　　3.肝細(xì)胞線粒體AQP8 mRNA的表達(dá)和對照組比較，膿毒癥組大鼠肝細(xì)胞線粒體AQP8 mRNA的表達(dá)增加(P＜0.01);治療組和預(yù)防組的線粒體AQP8 mRNA的表達(dá)低于膿毒癥組(P＜0.01);而對照組、治療組和預(yù)防組之間則沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　4.AQP8蛋白的表達(dá)和對照組比較，AQP8蛋白的相對表達(dá)量在其它3組明顯減少(P＜0.01);治療組和預(yù)防組的AQP8蛋白相對表達(dá)

13、量較膿毒癥組增多(P＜0.01)，在治療組和預(yù)防組之間則沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　5.通過羅丹明123檢測的肝細(xì)胞線粒體膜電位變化肝細(xì)胞線粒體膜電位用羅丹明123的MFI來表示，對照組肝細(xì)胞線粒體羅丹明123的MFI高于膿毒癥組、治療組和預(yù)防組(P＜0.01)，膿毒癥組羅丹明123的MFI低于治療組和預(yù)防組(P＜0.01)，治療組和預(yù)防組之間則沒有顯著性差異（P＞0.05）。直線相關(guān)性分析顯示，羅丹明123的MFI和A

14、QP8蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01），而羅丹明123的MFI與AQP8 mRNA之間呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。
　　6.血清TNF-α
　　與對照組比較，其它3組實(shí)驗(yàn)大鼠的TNF-α血清濃度顯著增加(P＜0.01)，TMP治療組及預(yù)防組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清TNF-α水平低于膿毒癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清TNF-α水平(P＜0.01)。TNF-α與羅丹明123的MFI呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，與AQP8蛋白表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01);

15、TNF-α與AQP8 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.膿毒癥狀態(tài)下，肝細(xì)胞線粒體膜的AQP8蛋白表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致線粒體膜電位降低，引起線粒體結(jié)構(gòu)的破壞。
　　2.川芎嗪對膿毒癥介導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷具有保護(hù)作用，可能是通過上調(diào)AQP8蛋白的表達(dá)來穩(wěn)定線粒體膜電位而起作用的。
　　3.川芎嗪并不是通過上調(diào)AQP8 mRNA的表達(dá)而上調(diào)AQP8蛋白的表達(dá)，可能是通過減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)起到上調(diào)A