川芎嗪改善膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體功能障礙及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　膿毒癥是一種由嚴(yán)重感染引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)的臨床綜合征?？梢鸲嗥鞴俟δ苷系K綜合征(MODS)，最終可引起器官衰竭，臨床預(yù)后差，死亡率高。在膿毒癥過(guò)程中，肝臟對(duì)清除細(xì)菌的防御反應(yīng)和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)起著重要的作用。此外，膿毒癥引起的多器官損傷和衰竭可能是由于線粒體功能惡化和細(xì)胞能量代謝衰竭引起的。線粒體通過(guò)提供能量，利用大約98％的全身氧來(lái)維持正常的細(xì)胞功能。因此，線粒體在維持正常的器官功能中起著重要的作用。另一方面，保持線粒

2、體結(jié)構(gòu)的完整性是正常的線粒體功能及能量代謝必不可少的。膿毒癥狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為細(xì)胞病理性缺氧，氧利用障礙，導(dǎo)致能量產(chǎn)生下降，而線粒體功能降低是細(xì)胞氧利用障礙的根本原因。膿毒癥時(shí)會(huì)出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)損傷與功能障礙，線粒體損傷的同時(shí)會(huì)誘發(fā)促炎介質(zhì)的釋放，加重炎癥反應(yīng)，同時(shí)線粒體功能障礙導(dǎo)致組織細(xì)胞產(chǎn)生能量不足，引起嚴(yán)重的微循環(huán)障礙，直至多器官功能衰竭。可見(jiàn)線粒體功能障礙往往與失調(diào)的全身炎癥反應(yīng)引起的多器官功能衰竭相關(guān);然而，線粒體功能障礙的確切

3、機(jī)制尚不完全清楚。
　　川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的一種活性提取物，廣泛應(yīng)用于抗炎和治療心血管疾病。TMP可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，作為滅活活性氧、保護(hù)酶的抗氧化劑。TMP還具有抗炎和器官保護(hù)作用，并在細(xì)胞水平上改善線粒體功能。然而，這些影響作用的分子機(jī)制仍然不清。水通道蛋白8(Aquaporin-8，AQP8)位于肝細(xì)胞內(nèi)線粒體膜，主要介導(dǎo)水和其他代謝底物的運(yùn)輸，對(duì)維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)十分必要。A

4、QP8還通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞快速腫脹，促進(jìn)IL-1β釋放而介導(dǎo)炎癥。另一方面，線粒體敲除AQP8基因能導(dǎo)致氧化劑誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和導(dǎo)致人肝腫瘤細(xì)胞壞死性死亡。在腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導(dǎo)的膿毒癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，肝細(xì)胞AQP8的表達(dá)可能通過(guò)其轉(zhuǎn)錄后抑制的機(jī)制而被下調(diào)，導(dǎo)致AQP8介導(dǎo)的水向線粒體外的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，線粒體體積的快速膨脹，線粒體破裂。這些證據(jù)表明AQP8可能在維持正常的線粒體功能中起重要的作用。以往的研究表明，川芎嗪可能通過(guò)

5、增加AQP8表達(dá)保護(hù)膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)。然而，TMP能否通過(guò)改善線粒體功能保護(hù)肝臟免受炎癥損害，在膿毒癥大鼠模型中AQP8和炎癥反應(yīng)之間是否存在相互影響仍不清楚。在當(dāng)前的研究中，試圖進(jìn)一步探討TMP對(duì)線粒體功能的影響，闡明TMP在治療膿毒癥致急性肝損傷中對(duì)線粒體保護(hù)作用的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　選用96只SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、膿毒癥組、TMP治療組和TMP預(yù)防組，每組24只。使用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal

6、 ligation and puncture，CLP)法制備膿毒癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅接受假手術(shù)處理;膿毒癥組進(jìn)行CLP手術(shù);治療組在CLP手術(shù)完成后，立即從大鼠尾靜脈注射鹽酸川芎嗪注射液，劑量為60mg/kg;預(yù)防組在CLP手術(shù)處理前7天開(kāi)始每天從大鼠尾靜脈注射60mg/kg鹽酸川芎嗪注射液。
　　造模18小時(shí)后，在四組大鼠中隨機(jī)抽取12只處死，留取肝臟和血清標(biāo)本，部分肝臟組織固定、包埋后保存，余肝臟組織及血清保存在零

7、下80℃冰箱中。每組剩余12只大鼠觀察至出現(xiàn)明顯膿毒癥癥狀及至死亡的時(shí)間，并繪制生存曲線。
　　生化分析儀直接檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平。提取部分肝臟組織標(biāo)本，采用ATP檢測(cè)試劑盒，測(cè)定組織中ATP含量。
　　取包埋后的大鼠肝臟制備50nm厚度的電鏡切片，使用4％的醋酸鈾酰和0.5％的醋酸鉛染色后，電鏡下觀察肝細(xì)胞線粒體

8、的超微結(jié)構(gòu);按照Flameng分級(jí)方法對(duì)肝臟線粒體進(jìn)行半定量分析。
　　差速離心法提取肝細(xì)胞線粒體，JC-1對(duì)線粒體進(jìn)行染色，激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，通過(guò)綠色熒光/紅色熒光的比值，間接反映線粒體膜電位變化。
　　取肝細(xì)胞線粒體，采用分光光度法，測(cè)定線粒體膜Na+-K-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。
　　裂解肝細(xì)胞線粒體，分離出線粒體內(nèi)膜蛋白，采用We

9、stern blot法檢測(cè)AQP8蛋白，采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法檢測(cè)肝組織AQP8mRNA的表達(dá)。
　　使用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時(shí)間、大鼠存活時(shí)間，大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平，血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平，大鼠肝細(xì)胞ATP含量，肝細(xì)胞線粒體膜ATP酶活性，AQP8mRNA表達(dá)、AQP8蛋白表達(dá)

10、使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組間比較采用方差分析(ANOVA)進(jìn)行處理;AQP8蛋白表達(dá)與血清ALT、AST、m-AST，肝細(xì)胞ATP含量，血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平的相關(guān)性分析使直線相關(guān)性檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠手術(shù)結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時(shí)間和存活時(shí)間
　　膿毒癥組大鼠手術(shù)結(jié)束至出現(xiàn)癥狀的時(shí)間較治療組和預(yù)防組短(P＜0.01);治療組和預(yù)防組的大鼠存活時(shí)間較膿毒癥組長(zhǎng)（

11、P＜0.01）;治療組和預(yù)防組兩組大鼠出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時(shí)間和存活時(shí)間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　2.肝臟組織中ATP含量及血清ALT、AST、m-AST的水平
　　與正常對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠肝臟組織中ATP含量明顯減低(P＜0.01);與膿毒癥組比較，治療組和預(yù)防組肝臟組織中ATP含量升高(P＜0.01)。
　　與正常對(duì)照組比較，膿毒癥組血清ALT、AST、m-AST的水平明顯升高(P＜0.01);與膿毒癥

12、組相比，治療組和預(yù)防組血清ALT、AST、m-AST的水平降低(P＜0.01)。
　　3.肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的變化
　　電鏡觀察大鼠肝細(xì)胞線粒體發(fā)現(xiàn)膿毒癥組線粒體體積增大，嵴明顯腫脹、并有空泡樣變，外膜破裂，線粒體內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性。而在治療組和預(yù)防組，大鼠肝細(xì)胞線粒體上述變化，如腫脹、空泡樣改變等均較膿毒癥組減輕。膿毒癥組肝臟線粒體電鏡半定量評(píng)分較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01);TMP治療組和預(yù)防組肝臟線粒體電鏡半定量評(píng)分較膿毒

13、癥組明顯降低(P＜0.01)。
　　4.肝臟細(xì)胞線粒體膜電位
　　激光共聚焦及流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝臟線粒體膜電位結(jié)果表明:膿毒癥組大鼠肝臟線粒體膜電位明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），而治療組和預(yù)防組大鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位高于膿毒癥組(P＜0.01)。
　　5.肝臟細(xì)胞線粒體ATP酶活性
　　與對(duì)照組比較，膿毒癥組肝細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

14、水平明顯下降(P＜0.01)，與膿毒癥組相比，治療組和預(yù)防組肝細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯升高(P＜0.01)。而治療組和預(yù)防組之間則沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　6.肝細(xì)胞線粒體AQP8mRNA的表達(dá)
　　與對(duì)照組比較，膿毒癥組大鼠肝細(xì)胞線粒體AQP8mRNA的表達(dá)降低（P＜0.01）;膿毒癥組線粒體AQP8mRNA的表達(dá)低于治療組和預(yù)

15、防組的(P＜0.01);而治療組和預(yù)防組之間則沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　7.肝細(xì)胞線粒體AQP8蛋白的表達(dá)
　　與對(duì)照組比較，肝細(xì)胞線粒體AQP8蛋白的相對(duì)表達(dá)量在膿毒癥組明顯減少(P＜0.01);治療組和預(yù)防組的AQP8蛋白相對(duì)表達(dá)量較膿毒癥組升高(P＜0.01)，在治療組和預(yù)防組之間則沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。
　　8.血清炎癥因子水平
　　與對(duì)照組比較，膿毒癥組大鼠血清IL-1β、IL-6

16、、HGMB1、TNF-α和NO水平顯著增加(P＜0.01)，而TMP治療組及預(yù)防組大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平低于膿毒癥組(P＜0.01)。
　　9.相關(guān)性分析
　　大鼠肝細(xì)胞線粒體AQP8蛋白的表達(dá)與血清ALT、AST、m-AST的水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，大鼠肝細(xì)胞線粒體AQP8蛋白的表達(dá)量與肝細(xì)胞ATP含量、線粒體膜電位水平呈正相關(guān)（P＜0.01）。大鼠肝細(xì)胞線粒體AQP8蛋白的表

17、達(dá)與血清NO、TNF-α水平負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.川芎嗪可以延緩大鼠CLP手術(shù)后出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時(shí)間，延長(zhǎng)膿毒癥大鼠的生存時(shí)間。
　　2.膿毒癥大鼠血清炎癥因子釋放增加，肝細(xì)胞線粒體AQP8、AQP8mRNA表達(dá)下降、并出現(xiàn)肝細(xì)胞ATP含量下降、線粒體ATP酶活性下降、線粒體膜電位下降等線粒體功能障礙，同時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)變化，還出現(xiàn)肝功能損害。而線粒體AQP8蛋白的表達(dá)與肝臟酶學(xué)指標(biāo)的呈負(fù)相關(guān)，與肝

18、細(xì)胞ATP含量及線粒體膜電位呈正相關(guān)，與血清TNF-α、NO水平呈負(fù)相關(guān)。
　　3.川芎嗪能改善膿毒癥大鼠的肝功能，保護(hù)肝細(xì)胞線粒體功能，其機(jī)制可能包括:
　　(1)川芎嗪可以通過(guò)上調(diào)線粒體AQP8蛋白的表達(dá)、保護(hù)線粒體ATP酶活性，穩(wěn)定線粒體膜電位來(lái)發(fā)揮對(duì)膿毒癥大鼠肝線粒體損傷的保護(hù)作用。
　　(2)川芎嗪可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6、HGMB1、NO等多種炎癥介質(zhì)的過(guò)量釋放，從而抑制膿毒癥發(fā)生時(shí)失控的炎