外周血DC在控制和傳播HIV感染中的作用研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)是人體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的一種抗原提呈細(xì)胞，在先天性免疫和獲得性免疫過程中均有重要作用。人血中DC主要分為CD123+DC和CD11c+DC二個(gè)亞群。最近研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染中，DC在抑制HIV復(fù)制和清除HIV的過程中可能發(fā)揮重要作用，但DC也可能參與HIV病毒在機(jī)體內(nèi)播散，目前DC在HIV傳播中的作用與機(jī)制尚不明確。DC-SIGN(DC-SIGN)是一類C-型凝集素受體，只在DC上表達(dá)

2、，能與初始T細(xì)胞表面的細(xì)胞粘附分子-3(ICAM-3)特異性結(jié)合，DC-SIGN在HIV病毒傳播中是否發(fā)揮作用呢?國外目前有關(guān)DC與HIV關(guān)系的研究較少，尚無定論，而且主要集中在經(jīng)性途徑感染人群。我國HIV感染者的免疫特性和感染途徑均不同于國外，DC在中國人群HIV感染中作用尚未見報(bào)導(dǎo)。本課題通過對(duì)中國HIV感染者不同感染階段DC數(shù)量和功能的變化以及DC在HIV傳播中的作用進(jìn)行研究，探討中國HIV/AIDS患者不同亞群DC絕對(duì)計(jì)數(shù)與HI

3、V-1感染及疾病進(jìn)展的關(guān)系，不同成熟狀態(tài)的DC在傳播HIV-1中的作用以及與HIV感染的關(guān)系。 主要方法1.研究對(duì)象：由遼寧省疾病預(yù)防與控制中心、吉林省疾病預(yù)防與控制中心以及中國醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)WB試驗(yàn)確認(rèn)為陽性的HIV/AIDS患者。所有標(biāo)本均在未接受抗病毒治療前采集。根據(jù)HIV/AIDS患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量和感染時(shí)間進(jìn)行分組。CD4+T細(xì)胞數(shù)量大于或等于414個(gè)/μl，未經(jīng)抗HIV治療，無艾滋病特征性

4、癥狀，感染時(shí)間超過10年者為HIV感染疾病長期不進(jìn)展者(LTNP)；CD4+T細(xì)胞數(shù)量小于414個(gè)/μl，大于或等于200個(gè)/μl為HIV慢性感染組；CD4+T細(xì)胞數(shù)量小于200個(gè)/μl為艾滋病組。健康對(duì)照來自體檢門診和實(shí)驗(yàn)室工作人員，抗HIV抗體陰性、血液系統(tǒng)及肝腎功能檢查結(jié)果正常，無免疫系統(tǒng)疾病史的健康人，性別、年齡均與研究對(duì)象匹配。 2.T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)：將20μlCD4/CD8/CD3TriTEST試劑加入TruCO

5、UNT管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，用FACSMULTISET軟件檢測并進(jìn)行自動(dòng)分析、計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。 3.CD123+DCs絕對(duì)值計(jì)數(shù)：將20μlLin1-FITC、10μlCD123-PE及10μlHLA-DR-PerCP試劑加入TruCount管中，加入100μl抗凝全血，室溫避光15min，加入免洗溶血素900μl

6、，室溫避光15min，應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測20萬個(gè)細(xì)胞，CELLQUEST軟件分析。 4.流式細(xì)胞儀分析：用三色熒光標(biāo)記法流式細(xì)胞技術(shù)測定的激發(fā)光為氬離子激光488nm譜線，獲取閾值設(shè)在FL-3上以去除大部分HLA-DR-PerCP陰性細(xì)胞(圖5)。以前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞群為門1(R1)，以表達(dá)HLA-DR-PerCP的細(xì)胞群為門2(R2)，再以R1×R2為門，通過分

7、析Lin1-FITC-/CD123-咒+細(xì)胞群(R3)分別得出所獲取CD123+DCs數(shù)。通過分析門4(R4)得出所獲取的熒光beads數(shù)13。根據(jù)BD公司試劑說明書按如下公式計(jì)算出CD123+DCs絕對(duì)值(個(gè)/μl)。CD123+DCs(個(gè)/μl)=獲取CD123+DCs細(xì)胞數(shù)/獲取beads數(shù)×內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)珠beads數(shù)/100 5.病毒載量測定：采用全自動(dòng)病毒載量測定儀(美國，Roche公司，CO-BAS)以RT-PCR方法測

8、定，按操作說明書進(jìn)行。結(jié)果用HIV-1RNA拷貝/ml表示，最低檢測范圍是400拷貝/ml。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，低于檢測范圍的結(jié)果視為400拷貝/ml。 6.病毒株TCID50檢測：HIV病毒株分別是本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的2株M嗜性分離株、2株T嗜性分離株。提取健康人PBMC，PHA刺激3天，用RP-MI-1640(含100UIL-2)重懸，調(diào)整濃度為4×106/ml，放入37℃溫箱中待用。在96孔板中部選12孔，每孔加入180ulRPMI

9、-1640，PBMC50μl。每孔加入200μl病毒(10倍稀釋)，在板上做10倍系列稀釋。3天后換液，第七天測p24，計(jì)算TCID50。 7.CD4+T細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞的分選：用密度梯度離心法提取5例正常人PBMC。采用德國Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分選裝置，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。 結(jié)果1.中國HIV/AIDS患者CD123+DCs數(shù)量明顯減少，LTNP組CD123+DCs高于HIV慢性感染組、A

10、IDS組，甚至高于正常對(duì)照：56例HIV/AIDS患者CD123+DCs絕對(duì)值為5.42(3.33個(gè)/μl(0.06-13.92個(gè)/μl)，顯著低于正常對(duì)照組7.84個(gè)/μl(3.45-13.97個(gè)/μl)(P＜0.01)。 22例LTNP的CD123+DCs絕對(duì)值為9.95個(gè)/μl(6.16-20.88個(gè)/μl)，顯著高于HIV/AIDS患者、HIV慢性感染組及AIDS組，甚至顯著高于正常對(duì)照組(7.84個(gè)/μl，3.45-1

11、3.97個(gè)/μl)(P＜0.01)。其中有2例LT-NP的CD123+DCs絕對(duì)值分別為18.32和20.88個(gè)/μl。與CD123+DCs絕對(duì)值不同的是，LTNP組CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值為820個(gè)/μl(520-1945個(gè)/μl)，與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(835個(gè)/μl，605-1632個(gè)/μl)(P＞0.05)。 17例HIV慢性感染者CD123+DCs絕對(duì)值為5.27個(gè)/μl(2.25-9.80個(gè)/μl)，顯著低于

12、正常對(duì)照組(7.84個(gè)/μl，3.45-13.97個(gè)/μl)(P＜0.01)。HIV慢性感染組CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值為325個(gè)/μl(238-368個(gè)/μl)，顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)。 AIDS組CD123+DCs絕對(duì)值為3.31個(gè)/μl(0.31-6.46個(gè)/μl)，顯著低于正常對(duì)照組、HIV慢性感染組及LTNP組(P＜0.01)。 2.中國HIV/AIDS患者CD123+DCs數(shù)量與疾病進(jìn)展明顯相關(guān)：5

13、6例HIV/AIDS患者CD123+DCs絕對(duì)值隨著CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及百分率的升高而升高，經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析得出，其與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和百分率均呈明顯正相關(guān)(r=0.422，P＜0.01；r=0.488，P＜0.01)。檢測不同疾病進(jìn)展階段的HIV感染者，我們發(fā)現(xiàn)LTNP組CD123+DCs數(shù)量顯著增加，HIV-1RNA病毒載量水平較低(3230拷貝/ml，＜400-9840拷貝/ml)；AIDS組CD123+

14、DCs數(shù)量顯著降低，HIV-1RNA病毒載量水平較高(24886拷貝/ml)(P＜0.01)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析得出，56例HIV/AIDS患者CD123+DCs絕對(duì)值與HIV-1RNA病毒載量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.444，P＜0.05)。 3.體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞的純度及成熟狀態(tài)：5例健康人CD14+單核細(xì)胞的純度均＞95％，加入GM-CSF和IL-4培養(yǎng)7天后，CD14表達(dá)水平明顯降低，不表達(dá)CD80、CD86，提

15、示CD14+單核細(xì)胞已經(jīng)分化為未成熟DC，加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)3天后，CD80、CD86與HLA-DR表達(dá)量明顯增加，提示未成熟DC已分化為成熟DC。 4.DC成熟狀態(tài)與不同嗜性HIV感染的關(guān)系：受T-嗜性HIV攻擊后，未成熟DC及成熟DC培養(yǎng)上清p24抗原含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長無明顯增加。受M-嗜性HIV攻擊后，未成熟DC培養(yǎng)上清p24抗原含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長明顯增加，成熟DC培養(yǎng)上清p24抗原含量不隨培養(yǎng)時(shí)間延長明顯增加。

16、 5.未成熟和成熟DC在M-嗜性HIV-1傳播中的作用：受M-嗜性HIV刺激未成熟DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，上清中p24含量逐漸增加，明顯高于未加入CD4+T細(xì)胞的對(duì)照組。 6.未成熟和成熟DC在T-嗜性HIV-1傳播中的作用：受T-嗜性HIV刺激未成熟DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，上清中p24含量逐漸增加，與未加入CD4+T細(xì)胞的對(duì)照組相比無顯著性差異。 7.抗DC-SIGN抗

17、體在HIV-1感染中的作用：用低濃度M-嗜性病毒株預(yù)刺激imDC、mDC、CD4+T細(xì)胞后分別與CD4+T細(xì)胞(5×105)共培養(yǎng)，imDC和mDC培養(yǎng)上清檢測到大量的p24抗原，對(duì)照組CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清p24含量無明顯變化。 結(jié)論1.中國HIV/AIDS患者CD123+DC數(shù)量減少，且隨疾病進(jìn)展逐漸下降。外周血CD123+DC在控制HIV感染方面有重要作用，與艾滋病進(jìn)展明顯相關(guān)。 2.中國人LTNP外周血CD123

18、.+DC數(shù)量顯著高于HIV慢性感染者及AIDS患者，甚至高于正常對(duì)照，提示CD123+DC對(duì)LTNP疾病進(jìn)程有保護(hù)性作用。 3.中國T-嗜性HIV不能在中國未成熟DC和成熟DC內(nèi)復(fù)制，M-嗜性HIV能在未成熟DC內(nèi)復(fù)制但不能在成熟DC內(nèi)復(fù)制，提示HIV能否在DC內(nèi)復(fù)制與HIV嗜性和DC成熟狀態(tài)有關(guān)。 4.抗DC-SIGN抗體對(duì)HIV-1體外感染活化CD4+T細(xì)胞具有抑制作用，提示DC-SIGN在DC向T細(xì)胞傳播HIV過程