血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體LOX-1在人腎小球系膜細(xì)胞和糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)中的表達(dá)研究.pdf

1、本文首先分別采用ox-LDL和D-葡萄糖與正常人腎小球系膜細(xì)胞(ItGMCs)共同孵育，研究了不同時間和不同濃度下LOX-1、TGF-β1的表達(dá)情況，并探討了LOX-1在TGF-β1表達(dá)中的作用，接下來又研究了糖尿病大鼠模型不同時期腎臟LOX-1和TGF-β1的表達(dá)情況，及其與血糖、血脂、24小時尿微量白蛋白量的相關(guān)性，以期了解LOX-1在DN發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制。 3-羥基3-甲基戊二酸輔酶A(HMG-CoA．)還原酶抑制劑(他汀

2、類藥物)的問世被喻為心腎保護的里程碑。它除了降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇之外，還可能通過其它機制發(fā)揮心腎保護功能，本實驗還研究了阿托伐他汀(Atorv)對人腎小球系膜細(xì)胞和糖尿病大鼠在不同時間腎臟表達(dá)LOX-1和TGF-β1的影響，以期了解他汀類藥物腎臟保護作用的機制。 材料與方法： 1．人腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定。取因腎腫瘤行單側(cè)腎切除者正常部分腎皮質(zhì)，充分切碎呈半糊狀，通過100目和200目尼籠篩網(wǎng)濾過，將200

3、目尼籠篩網(wǎng)上的腎小球經(jīng)0.6mg/mlⅣ型膠原酶消化后進(jìn)行原代培養(yǎng)，7-10天后傳代。細(xì)胞傳二代后，爬片培養(yǎng)，用細(xì)胞免疫化學(xué)方法染色檢驗胞漿內(nèi)肌動蛋白、結(jié)蛋白，角蛋白的染色情況，鑒定腎小球系膜細(xì)胞，并用油紅“O”染色，證明HGMCs吞噬ox-LDL。4-10代細(xì)胞用于實驗。 2．HGMCs接種在200ml．培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞接近于融合時，用不完全培養(yǎng)基同步24小時后，換用完全培養(yǎng)基。加入ox-LDL或D-葡萄糖，分別培養(yǎng)6、12、

4、24、48小時。加人不同濃度的ox-LDL或D-葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。加入JTX92(10μg/ml)或Atorv預(yù)處理30min，然后加入ox-LDL或D-葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用RT-PCR和/或Western法檢測所收集細(xì)胞的LOX-1、TGFβ1和p38MAPK水平，用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的TGFβ1含量。 3．建立糖尿病大鼠的動物模型。36只12周齡的健康雄性Wistar大鼠，體重200-250mg

5、，隨機選取10只作為對照組，試驗組26只。試驗組中26只鼠尾靜脈注射STZ(0.1M檸檬酸鹽緩沖液pH4.5溶)，按50mg/Kg．給藥，建立糖尿病模型；10只對照鼠尾部注射檸檬酸鹽緩沖液。3天后檢測鼠尾血糖，確定是否造模成功，如血糖未達(dá)到16.7mmol/L，再補注一次。26只糖尿病大鼠隨機分為2組，13只阿托伐他汀灌胃(15mg/Kg/d)，另13只僅生理鹽水灌胃。為預(yù)防大鼠死亡，兩組大鼠皮下注射2-4U/d長效胰島素。第4周和第8

6、周時各組分別處死6只大鼠,同時留24小時尿檢測微量白蛋白量，采血測定其血脂、血糖、HbAlc。取雙腎去包膜，凍存于液氮中用于半定量RT-PCR和Western印跡法檢測LOX-1、TGFβ1和p38MAPK含量。 4．MTT法細(xì)胞接種于96孔板，正常培養(yǎng)基生長3天，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗后，加入1％RPMll640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，留置空白和對照組，各實驗組分別加入1.2mg/dl、6mg/dl、12mg/dl的阿托伐他汀預(yù)處理30

7、min，暴露于終濃度為80μg/dl的ox-LDL中24小時后，每孔加入MTT20μl(5g/l)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后去除上清，然后每孔加入DMSO 150μl，輕輕振搖，約30min后在492nm波長的酶標(biāo)儀上測其A值并計算抑制率。 研究結(jié)果： 1．相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)生長活躍的人腎小球系膜細(xì)胞(HGMC)體積大，常為梭形、不規(guī)則星型或三角形、樹枝狀；細(xì)胞邊界不清楚，常有融合趨勢，可形成多核巨細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)有大量為細(xì)胞中軸平

8、行的微絲；當(dāng)細(xì)胞密集時可重疊生長。細(xì)胞傳二代后，消化后的細(xì)胞爬片培養(yǎng)，DAB染色發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)肌動蛋白、結(jié)蛋白為陽性；角蛋白為陰性，鑒定為腎小球系膜細(xì)胞。油紅“O”染色，細(xì)胞內(nèi)可見紅色吞噬顆粒，證明HGMCs吞噬ox-LDL。 2．ox-LDL(80μg/ml)孵育HGMCs，LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)從6h開始逐漸增加，24h達(dá)到高峰，48h略有下降，考慮與細(xì)胞凋亡有關(guān)；10μg/ml ox-LDL即有刺激HGMCs表達(dá)LOX

9、-1的作用，80μg/ml ox-LDL能力最強(P<0.01)。LOX-1特異性阻滯劑JTX92(10μg/ml)可以顯著抑制LOX-1的表達(dá)(P<0.01)。由此可見，在24h內(nèi)ox-LDL以時間和濃度依賴的方式增加HGMCs LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)。 3．ox-LDL(80μg/ml)孵育HGMCs，TGF-βlmRNA的表達(dá)從6h開始增加，24h達(dá)到平臺期，48h表達(dá)水平稍有下降，考慮與細(xì)胞凋亡有關(guān)。10μg/m

10、l ox-LDL即可HGMCs上調(diào)TGF-β1mRNA的表達(dá)，80μg/ml組作用最強，上調(diào)達(dá)4.5倍(P<0.01)。LOX-1特異性阻滯劑JTX92(10μg/ml)可以明顯抑制TGF-β1mRNA表達(dá)和蛋白分泌(P<0.01)。在24h內(nèi)ox-LDL以時間和濃度依賴的方式增加HGMCs TGF-β1m RNA的表達(dá)，JTx92對其具有抑制作用。 4．ox-LDL(10-80μg/ml)以濃度依賴的方式增加HGMCs內(nèi)p38

11、MAPK蛋白的表達(dá)，其中，80μg/ml組作用最顯著，上調(diào)達(dá)4.0倍(P<0.01)。JTX92(10μg/ml)可以顯著抑制p38MAPK蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)45％(P<0.01)。 5．阿托伐他汀(1.2-12μg/ml)對人腎小球系膜細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，抑制率分別為6.4％、22.5％、61.5％，呈劑量依賴方式。 6．Atorv(6μg/ml和12μg/ml)可以明顯對抗ox-LDL(80μg/ml)引

12、起的HGMCs LOX-1mRNA表達(dá)增加，分別下調(diào)14.5％和48.6％，其能力與劑量相關(guān)。 7．Atorv(6μg/ml和12μg/ml)對ox-LDL(80μg/ml)引起的p38MAPK蛋白活性增加有明顯的對抗作用，表達(dá)分別下調(diào)11.3％和37.1％(P<0.01)，呈劑量依賴性。 8．D-葡萄糖(600mg/dl)孵育HGMCs，LOX-1的表達(dá)從12h開始增加，48h達(dá)到高峰。300mg/dl D-葡萄糖可以

13、刺激HGMCs LOX-1表達(dá)，但600mg/dl D-葡萄糖作用最強(P<0.01)。JTX92(10μg/ml)可以抑制D葡萄糖誘導(dǎo)的LOX-1的表達(dá)(P<0.05)。由此可見，D-葡萄糖以時間和濃度依賴的方式增加HGMCs LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)。 9．D-葡萄糖(600mg/dl)孵育HGMCs，12h TGF-β1mRNA的表達(dá)和蛋白分泌開始明顯增加，48h作用最強(P<0.01)。600mg/dl組D-葡萄糖

14、刺激HGMCs表達(dá)TGF-β1能力最顯著(與對照組比較，P<0.01)。JTX92(10μg/ml)可以明顯對抗D-葡萄糖刺激HGMCs表達(dá)TGF-β1(與D-葡萄糖600 mg/dl組比較，P<0.01)。可見，D-葡萄糖以時間和濃度依賴的方式增加TGF-β1mRNA的表達(dá)和蛋白分泌。 研究結(jié)論： 1．在24小時內(nèi)ox-LDL以時間和濃度依賴的方式引起人腎小球系膜細(xì)胞LOX-1和TGFβ1表達(dá)上調(diào)，在48小時稍有降低，

15、考慮與細(xì)胞凋亡有關(guān)。LOX-1特異性抗體JTX92(10μg/ml)阻止ox-LDL的作用，提示LOX-1可能介導(dǎo)ox-LDL引起的TGFβ1表達(dá)上調(diào)。 2．ox-LDL以濃度依賴的方式激活p38MAPK信號途徑，LOX-1特異性抗體JIX92(10μg/ml)阻止ox-LDL的作用，提示ox-LDL可能通過與LOX-1結(jié)合激活胞內(nèi)p38MAPK途徑，引起系膜細(xì)胞合成并分泌大量TGFβ1，引起腎臟病變的發(fā)生發(fā)展。 3．A

16、torv抑制ox-LDL(80μg/ml)激活的p38MAPK信號途徑，抑制細(xì)胞增殖，對抗ox-LDL引起的LOX-1 m RNA表達(dá)上調(diào)，從而在預(yù)防和治療伴有血脂異常的糖尿病腎臟病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 4．D-葡萄糖能以時間和濃度依賴的方式增加LOX-1基因和蛋白水平的表達(dá)，并刺激人腎小球系膜細(xì)胞合成并分泌大量TGF-β1。D-葡萄糖通過激活細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK信號傳遞系統(tǒng)，上調(diào)LOX-1 mRNA表達(dá)和蛋白的合成，