靶向Rb的siRNA真核表達(dá)載體與納米磁小體靶向藥囊聯(lián)合作用人膽管癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　 膽管癌主要指源于肝外膽管的惡性腫瘤，預(yù)后不佳。流行病學(xué)少見(jiàn)，國(guó)外尸檢發(fā)現(xiàn)率為0.01％～0.5％，占惡性腫瘤總數(shù)3％，我國(guó)尸檢占0.07％～0.3％，其檢出率逐年增高。膽管癌占所有膽道疾病總數(shù)的2.32％，男女之比為1.46：1。近年來(lái)其發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。膽管癌的治療方法多采用以手術(shù)為主放化療為輔的綜合膽管癌的治療方法多采用以手術(shù)為主放化療為輔的綜合治療。但由于其位置深、隱蔽、早期發(fā)現(xiàn)困難，使手術(shù)治療效果很差

2、，生存率低?；熕幬锿ㄟ^(guò)作用在細(xì)胞繁殖的不同環(huán)節(jié)，抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療的目的，已成為當(dāng)今臨床治療腫瘤的重要手段。但是目前中晚期膽管癌的化療效果很不令人滿意。既往報(bào)道以5-氟尿嘧啶為主的單藥或聯(lián)合化療的有效率為14％～18％。
　　 運(yùn)用納米技術(shù)和化療藥物相結(jié)合的方法，在磁導(dǎo)向的作用下靶向性治療惡性腫瘤是近年來(lái)興起的一種新的治療手段。載藥的磁性納米微粒是納米技術(shù)和化療藥物相結(jié)合的產(chǎn)物。在磁導(dǎo)向作用下聚集在腫瘤部位，這不

3、僅提高了腫瘤局部的化療藥物濃度，而且納米顆粒本身的可控性降解可使載體內(nèi)的化療藥物持續(xù)性釋放，使藥物在血液中循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)并維持有效的血藥濃度，且可減少代謝產(chǎn)物，易于清除，副作用少。為惡性腫瘤的綜合治療帶來(lái)了新的希望和途徑。
　　 在鄒聲泉教授的領(lǐng)導(dǎo)下，我們課題組不僅成功獲得了國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)資助的重大課題《納米生物磁小體靶向藥囊治療肝膽胰惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究》(編號(hào)2002AA214061)。該項(xiàng)目的核心內(nèi)容是

4、：采用高新技術(shù)研制磁化納米金屬薄膜包覆的支架，在通暢膽道引流的同時(shí)，可增強(qiáng)5-Fu納米磁小體靶向藥囊的靶向性，真正達(dá)到高選擇性區(qū)域性化療的目的，以實(shí)現(xiàn)膽管癌治療觀念中的創(chuàng)新和突破。而且在前期的研究中我們對(duì)膽管癌腫瘤生物學(xué)特性有了深入的研究，認(rèn)識(shí)到膽管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中各種致癌因子和抑癌因子中存在著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)式的反饋機(jī)制，其中Rb的蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到重要的作用。在肝外膽管癌的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究取得了很大的進(jìn)展。

5、　　 在此基礎(chǔ)上，我們擬構(gòu)建針針對(duì)Rb的RNAi真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞中，觀察對(duì)Rb蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及對(duì)膽管癌生長(zhǎng)的影響。并與納米磁小體靶向藥囊聯(lián)合作用人膽管癌細(xì)胞，觀察在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中它們的聯(lián)合作用對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 研究方法：
　　 根據(jù)Rb基因cDNA序列，設(shè)計(jì)出針對(duì)目的基因的4個(gè)siRNA靶序列?？寺〉秸婧吮磉_(dá)載體pGenesil vector中，通過(guò)酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定正確與

6、否。將構(gòu)建好的4個(gè)siRNA表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染到QBC939細(xì)胞中MTT法、FCM，檢測(cè)Rb基因沉默后膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)變化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Rb的mRNA和蛋白在膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，同時(shí)檢查與Rb相關(guān)的基因的表達(dá)情況。將QBC939細(xì)胞接種于裸鼠皮下，建立膽管癌裸鼠種植模型，觀察體內(nèi)種植瘤的發(fā)生率和生長(zhǎng)情況。通過(guò)急性毒性試驗(yàn)找出TM5-FuNC對(duì)裸鼠的半數(shù)致死量(LD50)。根據(jù)急性毒

7、性試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定合適的藥物劑量。MTT檢測(cè)TM5-FuNC對(duì)轉(zhuǎn)染psiRNARb-1前后QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響。將裸鼠模型再分成4組，分別為對(duì)照組，5-Fu組，TM5-FuNC組，psiRNARb-1和TM5-FuNC聯(lián)合組。觀察腫瘤體積變化，計(jì)算抑瘤率，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建了針對(duì)Rb的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染psiRNARb-1質(zhì)粒48至72小時(shí)后QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞受到了

8、一定程度的抑制，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)Rb基因在QBC939細(xì)胞中表達(dá)沉默時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，在72小時(shí)內(nèi)呈一定的時(shí)間依賴(lài)性。轉(zhuǎn)染后QBC939細(xì)胞中Rb的mRNA表達(dá)相較于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯下調(diào)，Rb蛋白表達(dá)也明顯受抑制。P16的mRNA和蛋白的表達(dá)變化情況與Rb相反。E2F1轉(zhuǎn)錄因子mRNA和蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)與Rb相同。轉(zhuǎn)染組中P27kip1蛋白的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組有所增強(qiáng)。TM5-FuNC的急性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物均未死亡，最大

9、耐受劑量為1250 mg/kg。是臨床給藥劑量的5倍。TM5-FuNC 250和200mg/kg組的移植腫瘤體積在治療后35天與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)。電境結(jié)果顯示，TM5-FuNC對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，且隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變?cè)矫黠@。轉(zhuǎn)染psiRNARb-1的QBC939細(xì)胞可顯著增強(qiáng)TM5-FuNC和5-Fu的生長(zhǎng)抑制作用(P<0.05)。TM5-FuNC和TM5-FuNC＋psiRNAR

10、b-1聯(lián)合組與對(duì)照組和5-Fu組比較腫瘤體積的生長(zhǎng)有明顯差異(P<0.001)。TM5-FuNC和TM5-FuNC＋psiRNARb-1聯(lián)合組之間比較(P＝0.44)有一定的差異顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了4對(duì)針對(duì)Rb的siRNA真核表達(dá)載體，其中轉(zhuǎn)染的psiRNARb-1質(zhì)粒對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞有一定的抑制作用,并可誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞G0/G1期阻滯和細(xì)胞凋亡。這種作用可能跟Rb與p16、E2F1

11、、P27kip1之間的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。為我們將Rb作為基因治療的靶目標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 2、通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)，我們獲得了TM5-FuNC最大耐受劑量為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了用藥依據(jù)。
　　 3、TM5-FuNC新劑型在內(nèi)磁場(chǎng)的導(dǎo)向作用下能有效抑制人膽管癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，使我們所研制的TM5-FuNC納米藥物制劑結(jié)合內(nèi)磁場(chǎng)靶向治療膽管癌的設(shè)計(jì)理念獲得了實(shí)驗(yàn)的證實(shí)即可磁化的NiTi合金支架在保持膽道通暢引流的情況下，能高靶