LIMK1-cofilin信號(hào)通路調(diào)控BDNF誘導(dǎo)的軸突生長和厭惡性記憶消退的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　 肌動(dòng)蛋白(Actin)是一種細(xì)胞骨架蛋白，它在細(xì)胞生理功能方面發(fā)揮了重要的作用，包括胞漿分裂、內(nèi)吞、神經(jīng)生長等。肌動(dòng)蛋白發(fā)揮它的生物學(xué)功能主要是通過肌動(dòng)蛋白重組(Actin remodeling)，即單體肌動(dòng)蛋白(G-actin)和絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)之間的動(dòng)態(tài)變化。肌動(dòng)蛋白重組受多種蛋白的調(diào)控，例如ADF/cofilin、Arp2/3、Eps8、Profilin、myosinⅡ、myosinⅤ。由于AD

2、F/cofilin廣泛分布于所有的真核細(xì)胞，并且對(duì)肌動(dòng)蛋白重組具有最直接的調(diào)控功能，且對(duì)發(fā)育具有重要的作用，逐漸成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移、生殖系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的研究熱點(diǎn)。
　　 神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮正常的生理功能依賴于神經(jīng)細(xì)胞正常的生長發(fā)育及分化。在神經(jīng)元極性分化的過程中，軸突的生長早于樹突，軸突末端的膨大稱為生長錐(Growth cone)，由絲狀偽足(Filopodia)和板狀偽足（Lamellipodia）構(gòu)成，它們

3、的動(dòng)態(tài)變化指引了軸突生長的方向。在軸突生長錐的胞膜附近富含肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)變化是軸突生長的基礎(chǔ)。神經(jīng)營養(yǎng)因子尤其是目前研究最多的BDNF對(duì)神經(jīng)元的生長、分化、存活及突觸可塑性方面具有非常重要的作用。盡管如此，BDNF如何調(diào)控肌動(dòng)蛋白重組促進(jìn)神經(jīng)元生長發(fā)育的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 在成年哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元絕大多數(shù)以化學(xué)性突觸的形式互聯(lián)，形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)?；瘜W(xué)性突觸大多是由突觸前神經(jīng)元的軸突末梢和突觸后神

4、經(jīng)元的樹突棘及兩者之間的突觸間隙組成。這種突觸具有可塑性，表現(xiàn)為突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)具有可調(diào)控性，突觸后膜的形態(tài)及受體數(shù)目具有可變性。肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)作為細(xì)胞骨架成分之一是維持突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解聚和聚合與突觸后膜AMPA受體內(nèi)吞和上膜也有密切的聯(lián)系。肌動(dòng)蛋白的重組具有直接調(diào)節(jié)突觸傳遞效率的作用，包括長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)與長時(shí)程減弱(LTD)，因此肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化是突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。雖然cofilin是調(diào)節(jié)肌動(dòng)

5、蛋白重組的關(guān)鍵分子，但是cofilin調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的具體機(jī)制仍然不清楚。
　　 目的:
　　 1.分析LIMK1/cofilin信號(hào)通路與BDNF及其受體TrkB的關(guān)系，并深入探討LIMK1/cofilin信號(hào)通路參與調(diào)控BDNF誘導(dǎo)的軸突生長的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究BDNF基因突變導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育異常疾病的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。
　　 2.分析LIMK1/cofilin信號(hào)通路在學(xué)習(xí)記憶方面的作用，并深入研

6、究條件性厭惡記憶消退過程IrL腦區(qū)中LIMK1/cofilin信號(hào)通路的作用及其機(jī)制，為今后研究以LIMK1/cofilin為靶點(diǎn)的臨床相關(guān)疾病的治療措施提供新思路。
　　 方法：
　　 1.LIMK1/cofilin信號(hào)通路調(diào)控BDNF誘導(dǎo)的軸突生長的機(jī)制研究
　　 1.1、LIMK1與TrkB之間相互作用的檢測(cè)
　　 通過免疫共沉淀的方法分別檢測(cè)外源性過表達(dá)LIMK1與TrkB的HEK293細(xì)胞裂解液

7、和正常大鼠腦組織或神經(jīng)元裂解液中LIMK1與TrkB能否相互結(jié)合。為了排除細(xì)胞裂解后使不同亞細(xì)胞器中的蛋白釋放入裂解液中出現(xiàn)人為的結(jié)合，我們采用免疫熒光共定位的方法檢測(cè)兩種蛋白是否存在空間上的重疊性。從而證明TrkB與LIMK1在胞內(nèi)發(fā)生相互作用的可能。
　　 1.2、分析BDNF短時(shí)間刺激海馬神經(jīng)元對(duì)LIMK1蛋白的影響
　　 體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元用BDNF刺激30分鐘，通過蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)裂解液中LIMK1的磷

8、酸化及二聚化情況，來反映LIMK1的活性變化。另外分離海馬神經(jīng)元的胞漿和胞膜成分，分別檢測(cè)兩種成分中LIMK1含量的變化，來反映LIMK1在胞內(nèi)的分布情況。
　　 1.3、TrkB與LIMK1發(fā)生相互作用的序列分析
　　 采用逐步缺失的方法，設(shè)計(jì)TrkB不同氨基酸序列突變體，分別和LIMK1進(jìn)行外源性的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，篩選出TrkB上與LIMK1相互結(jié)合的氨基酸序列，并將該序列嫁接到不能與LIMK1結(jié)合的T1蛋白上，再次

9、進(jìn)行外源性的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，從而證明該氨基酸序列與LIMK1結(jié)合的必要性和充分性。
　　 1.4、設(shè)計(jì)特異性抑制劑干擾TrkB與LIMK1的結(jié)合
　　 將篩選出來的TrkB中與LIMK1結(jié)合的氨基酸序列與具有穿膜作用短肽Tat進(jìn)行融合，并對(duì)其進(jìn)行生物素標(biāo)記，以便于檢測(cè)。用免疫熒光染色的方法檢測(cè)該人工合成的融合肽是否能夠進(jìn)入胞內(nèi)，用外源性和內(nèi)源性免疫共沉淀的方法檢測(cè)該抑制劑的干擾效率。并應(yīng)用該抑制劑后再次檢測(cè)BDNF刺激對(duì)

10、LIMK1的生化特點(diǎn)的影響，來反映BDNF引起的LIMK1的各種變化是否依賴于TrkB與LIMK1的相互作用。
　　 1.5、分析BDNF長時(shí)間刺激海馬神經(jīng)元對(duì)LIMK1蛋白的影響
　　 體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元給予蛋白合成抑制劑后，再用BDNF刺激不同時(shí)間，最長達(dá)20h，檢測(cè)LIMK1含量的變化，來反映BDNF刺激對(duì)LIMK1降解的影響。
　　 1.6、分析藥物干預(yù)TrkB與LIMK1相互作用對(duì)BDNF誘導(dǎo)的軸突生

11、長的影響
　　 在神經(jīng)元中過表達(dá)LIMK1或用小干擾RNA(siRNA)抑制LIMK1的表達(dá)，然后用免疫熒光染色的方法檢測(cè)BDNF刺激對(duì)軸突生長的作用，來反映BDNF促進(jìn)軸突生長的作用是否依賴于LIMK1。然后用人工合成的Tat融合肽干擾內(nèi)源性TrkB與LIMK1的相互作用，檢測(cè)BDNF對(duì)軸突生長的促進(jìn)作用。此外，通過免疫熒光染色方法檢測(cè)軸突生長錐(Growthcone)中LIMK1、cofilin的磷酸化及肌動(dòng)蛋白actin的

12、聚合情況，來反映LIMK1/cofilin信號(hào)通路調(diào)控軸突生長的下游機(jī)制。
　　 2.LIMK1/cofilin信號(hào)通路調(diào)控條件性厭惡記憶消退的機(jī)制研究
　　 2.1、條件性味覺厭惡記憶模型的建立及各腦區(qū)中cofilin活性檢測(cè)
　　 建立條件性味覺厭惡(CTA)行為學(xué)模型，分別在CTA記憶獲得和消退過程的不同時(shí)間點(diǎn)取不同區(qū)域腦組織，采用蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)cofilin的磷酸化水平變化及cofilin的上游激

13、酶LIMK1和磷酸酶SSH1的磷酸化變化情況，來反映cofilin活性變化的分子機(jī)制。
　　 2.2、測(cè)試藥物干預(yù)對(duì)行為學(xué)的影響
　　 在大鼠IrL腦區(qū)內(nèi)埋管進(jìn)行微量注射Tat融合肽抑制或增強(qiáng)cofilin活性及抑制GluA2上膜，觀察對(duì)條件性味覺厭惡記憶及恐懼記憶消退的影響，來進(jìn)一步證實(shí)cofilin活性對(duì)記憶消退的重要性及其機(jī)制。
　　 2.3、檢測(cè)突觸體及其膜表面中谷氨酸受體的變化
　　 從腦組織中

14、抽提突觸體進(jìn)行裂解檢測(cè)各亞型AMPA受體及NMDA受體的含量變化，或?qū)⑻崛〉耐挥|體進(jìn)行膜表面蛋白的生物素標(biāo)記，用含有親和素的瓊脂糖珠子進(jìn)行沉淀，獲得膜表面蛋白的混合溶液，然后用蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)突觸體膜表面各谷氨酸受體亞型的含量變化。
　　 2.4、觀察突觸體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化
　　 采用高爾基染色的方法觀察CTA記憶消退過程中及藥物干預(yù)cofilin活性后樹突棘形態(tài)和密度的變化，來判斷CTA記憶消退過程中突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的

15、變化是否和突觸傳遞效率的變化相同步。
　　 結(jié)果：
　　 1.LIMK1/cofilin信號(hào)通路調(diào)控BDNF誘導(dǎo)的軸突生長的機(jī)制研究
　　 1.1、LIMK1與TrkB之間存在相互作用
　　 在體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中過表達(dá)HA標(biāo)記的LIMK1(HA-LIMK1)和Flag標(biāo)記的TrkB(Flag-TrkB)，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。HA-LIMK1可以將Flag-TrkB沉淀下來，反之用Flag-Trk

16、B也可以將HA-LIMK1免疫沉淀下來。此外，在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，用免疫熒光染色的方法發(fā)現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記的LIMK1與綠色熒光標(biāo)記的TrkB存在部分重疊。
　　 1.2、BDNF短時(shí)間刺激體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元可以引起LIMK1磷酸化、二聚化及胞內(nèi)分布情況的變化
　　 在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液中加入BDNF刺激30分鐘，收集細(xì)胞裂解液，通過蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)到p-LIMK1增加。在收集的蛋白裂解液中用不含β巰

17、基乙醇和二巰基蘇糖醇的上樣緩沖液98℃加熱，防止破壞二硫鍵，BDNF刺激后可以出現(xiàn)LIMK1的二聚化。此外，分別抽提胞漿成分和胞膜成分，BDNF刺激30分鐘引起胞漿中的LIMK1降低，胞膜中LIMK1水平升高。
　　 1.3、TrkB蛋白JM區(qū)域中的9個(gè)氨基酸介導(dǎo)與LIMK1蛋白的結(jié)合
　　 將TrkB蛋白的胞內(nèi)域進(jìn)行逐步缺失突變，發(fā)現(xiàn)缺失C末端(ACT)、缺失激酶區(qū)(ATK)后，TrkB仍能與LIMK1結(jié)合，但是進(jìn)一步

18、缺失近膜區(qū)即胞內(nèi)域全部缺失(JM0)后，則不能與LIMK1結(jié)合。然后將JM區(qū)域細(xì)分成5個(gè)小片段，仍然采用逐步缺失突變的方法，發(fā)現(xiàn)JM5、JM4能和LIMKi結(jié)合，而JM3、JM2、JM1及JM0不能與LIMK1結(jié)合，因此JM4與JM3之間的差別序列(VIENPQYFG)為介導(dǎo)TrkB與LIMK1結(jié)合的關(guān)鍵序列。此外，我們將這9個(gè)氨基酸嫁接到T1蛋白上，發(fā)現(xiàn)原本不能與LIMK1結(jié)合的T1也可以與LIMK1結(jié)合。
　　 1.4、干擾

19、TrkB與LIMK1的結(jié)合抑制BDNF引起的LIMK1的磷酸化、二聚化及胞內(nèi)分布的變化
　　 將篩選出的介導(dǎo)TrkB與LIMK1結(jié)合的氨基酸序列嫁接到穿膜肽Tat上(Tat-JMBox4)，發(fā)現(xiàn)該融合肽能成功的進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，并能有效抑制TrkB與LIMK1的相互結(jié)合。用該人工合成的短肽封閉TrkB與LIMK1的相互作用后，發(fā)現(xiàn)BDNF引起的LIMK1的磷酸化、二聚化及胞內(nèi)分布變化的現(xiàn)象被抑制。
　　 1.5、BDNF長

20、時(shí)間刺激可以延緩LIMK1的降解
　　 在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液中，加入BDNF分別刺激1、5、15、20h后收集裂解液，發(fā)現(xiàn)LIMK1的蛋白水平升高。如果在加入BDNF之前，提前加入蛋白合成抑制劑放線菌酮(cycloheximide)，發(fā)現(xiàn)加入BDNF組比不加BDNF組，LIMK1的半衰期延長，而用Tat-JMBox4干擾TrkB與LIMK1的相互作用后，BDNF對(duì)LIMK1的穩(wěn)定作用被抑制。
　　 1.6、BD

21、NF誘導(dǎo)軸突生長依賴于TrkB與LIMK1的相互作用
　　 在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中過表達(dá)LIMK1或者用小干擾RNA(siRNA)干擾LIMK1的表達(dá)，然后再用BDNF刺激，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LIMK1組神經(jīng)元軸突快速生長，而干擾LIMK1表達(dá)后，BDNF促進(jìn)軸突生長的作用被抑制。而且，用Tat-JMBox4抑制TrkB與LIMK1相互作用后，BDNF誘導(dǎo)軸突生長的功能被抑制。
　　 2.LIMK1/cofilin信號(hào)通路調(diào)控

22、條件性厭惡記憶消退的機(jī)制研究
　　 2.1、CTA記憶消退過程IrL腦區(qū)中cofilin活性增高
　　 消退測(cè)試第一天(E1)不同時(shí)間點(diǎn)取腦組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)p-cofilin在測(cè)試后0.5h和2h明顯升高。第三天消退測(cè)試(E3)后0.5h與第一天進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)p-cofilin明顯降低，即cofilin活性增高。
　　 2.2、CTA記憶消退過程中p-LIMK1和p-SSH1水平均降低
　　 消退第三天

23、(E3)p-LIMK1和p-SSH1水平比消退第一天(E1)明顯降低，即在CTA記憶消退過程中LIMK1活性降低而SSH1活性升高。
　　 2.3、藥物干預(yù)cofilin活性影響CTA記憶的消退進(jìn)程
　　 在前三次記憶消退測(cè)試后，在IrL腦區(qū)立即注射Tat-Ser3增加cofilin活性可以加速CTA記憶消退，而注射Tat-pSer3降低cofilin活性則阻礙CTA記憶消退。然而，在前三次記憶消退后4h，在IrL腦區(qū)中

24、給予這兩種藥物均對(duì)CTA記憶消退沒有影響。
　　 2.4、CTA記憶消退過程中突觸體及其膜表面AMPA受體含量增加
　　 在CTA記憶消退過程中，IrL腦區(qū)的突觸體及其膜表面G1uA1和GluA2的含量顯著升高，而GluA3、G1uA4及NR-1則沒有明顯變化。但是，CTA記憶消退過程中，IrL腦區(qū)總的腦組織裂解液中GluA1和GluA2的含量沒有變化。
　　 2.5、藥物干預(yù)cofilin活性影響突觸后AMPA

25、受體水平
　　 在CTA記憶消退的前三天，用Tat-Ser3增加cofilin活性，可以引起G1uA1和GluA2在突觸體膜表面的含量，而用Tat-pSer3抑制cofilin活性則顯著降低了GluA1和GluA2在突觸體膜表面的含量。
　　 2.6、CTA記憶消退過程中突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化
　　 在CTA記憶消退過程中，樹突棘頭頸比(head/neckratio)及樹突棘的密度均未發(fā)生明顯的變化，即使用Ta

26、t短肽干擾cofilin的活性也對(duì)樹突棘的形態(tài)及密度沒有影響。
　　 2.7、GluA2上膜抑制劑阻礙CTA記憶的消退
　　 在CTA記憶消退前三天給予GluA2上膜的抑制劑(Tat-pepR845A)，或者在給予Tat-Ser3增加cofilin活性的同時(shí)給予GluA2上膜的抑制劑，發(fā)現(xiàn)CTA記憶消退進(jìn)程減慢。
　　 結(jié)論：
　　 1.BDNF引起LIMK1蛋白發(fā)生磷酸化、二聚化及胞內(nèi)重新分布的現(xiàn)象依賴

27、于TrkB與LIMK1的相互作用，LIMK1蛋白的二聚化使LIMK1蛋白穩(wěn)定性增加，活性增強(qiáng)，通過磷酸化cofilin蛋白促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，從而促進(jìn)軸突的生長。
　　 2.記憶消退過程中激酶LIMK1蛋白和磷酸酶SSH1蛋白的協(xié)同作用，使得cofilin蛋白活性增強(qiáng)，雖然cofilin蛋白活性的增加沒有引起樹突棘的大小和密度發(fā)生變化，但是cofilin蛋白活性的增高促進(jìn)了AMPA受體向突觸體及膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)，引起突觸后傳遞效率增加

28、，從而加速了記憶消退進(jìn)程。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.LIMK1/cofilin信號(hào)通路調(diào)控BDNF誘導(dǎo)的軸突生長的機(jī)制研究
　　 1.1、研究發(fā)現(xiàn)了一種能與TrkB蛋白相互作用的新分子即LIMK1蛋白，并且找出了TrkB分子中與LIMK1相結(jié)合的具體的氨基酸序列。
　　 1.2、發(fā)現(xiàn)BDNF刺激海馬神經(jīng)元對(duì)LIMK1存在兩種不同的影響，即短時(shí)間作用可促進(jìn)LIMK1活性增加并引起LIMK1在胞內(nèi)重新分布，長