HDAC3和NCoR介導(dǎo)了Ataxin-3缺失誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄異常.pdf

1、本文主要從Ataxin-3敲除導(dǎo)致基因表達(dá)譜改變、EphA3基因啟動(dòng)子區(qū)域定位表達(dá)及活性分析、HDAC3和NCoR介導(dǎo)了ataxin-3對(duì)EphA3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控三個(gè)方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分:Ataxin-3敲除導(dǎo)致基因表達(dá)譜改變
　　目的:采用基因表達(dá)芯片技術(shù)(Microarray)觀察ataxin-3敲除對(duì)基因表達(dá)變化的影響。
　　方法:選取ataxin-3敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(ataxin-3 KO M

2、EF)和正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(ataxin-3 WT MEF)為研究對(duì)象,提取RNA并用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)觀察ataxin-3敲除對(duì)基因表達(dá)的影響,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)ThomsonReuters/GeneGo公司的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析,并采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)證實(shí)基因表達(dá)芯片結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果:與正常細(xì)胞相比,ataxin-3敲除導(dǎo)致410個(gè)基因表達(dá)明顯異常(基因表達(dá)信號(hào)上調(diào)或下調(diào)超過2倍及以上),其中260個(gè)基因

3、表達(dá)上調(diào),而150個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。GeneGo軟件分析這410個(gè)基因的生物學(xué)功能,并對(duì)其功能進(jìn)行分類。發(fā)現(xiàn)ataxin-3敲除導(dǎo)致多個(gè)細(xì)胞通路轉(zhuǎn)錄異常,尤其是炎癥免疫和細(xì)胞粘附相關(guān)基因。
　　結(jié)論:Ataxin-3分子丟失導(dǎo)致多種細(xì)胞通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄異常。
　　第二部分:EphA3基因啟動(dòng)子區(qū)域定位表達(dá)及活性分析
　　目的:構(gòu)建含有不同長度EphA3基因啟動(dòng)子片段的報(bào)告基因載體,研究其在293T細(xì)胞和MEF細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

4、活性。
　　方法:以Balb/C小鼠基因組DNA為模板,擴(kuò)增不同長度的EphA3基因啟動(dòng)子片段,并克隆進(jìn)入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic真核表達(dá)載體內(nèi)。酶切鑒定及基因測(cè)序無誤后,將重組質(zhì)粒和pRL-CMV內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T或MEF細(xì)胞,分析不同長度的EphA3基因啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果:酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果提示表達(dá)載體構(gòu)建成功,EphA3基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-279～+110bp之間,在293

5、T細(xì)胞和MEF細(xì)胞中啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性相似。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,并確定了EphA3基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域。
　　第三部分:HDAC3和NCoR介導(dǎo)了ataxin-3對(duì)EphA3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(SCA3)是多聚谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病的一種,其疾病基因編碼一個(gè)小分子蛋白ataxin-3。Ataxin-3蛋白外顯子區(qū)域CAG異?？截悓?dǎo)致疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)Ataxin-

6、3分子是一個(gè)去泛素化酶,調(diào)節(jié)某些蛋白的活性和穩(wěn)定性,是泛素-蛋白酶體的重要成分。同時(shí),ataxin-3分子也參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控,病理性ataxin-3導(dǎo)致多種細(xì)胞通路基因轉(zhuǎn)錄異常,加重疾病進(jìn)程。為探討正常Ataxin-3分子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制,選用ataxin-3 KO MEF和ataxin-3 WT MEF細(xì)胞為研究對(duì)象?；虮磉_(dá)芯片、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡結(jié)果均顯示ataxin-3敲除導(dǎo)致EphA3基因表達(dá)明顯上調(diào)。因此構(gòu)建了Ep

7、hA3基因的啟動(dòng)子片段,雙熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)ataxin-3缺失導(dǎo)致EphA3基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng),而瞬時(shí)表達(dá)人源ataxin-3分子進(jìn)入ataxin-3 KO MEF細(xì)胞內(nèi)可抑制EphA3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。為闡明ataxin-3分子對(duì)EphA3基因啟動(dòng)子調(diào)控的機(jī)制,采用染色體免疫共沉淀技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然ataxin-3分子不能直接結(jié)合到EphA3啟動(dòng)子區(qū)域,但可以調(diào)節(jié)EphA3啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3和H4乙?；乃健＿M(jìn)一步

8、免疫印跡結(jié)果證實(shí)Ataxin-3丟失導(dǎo)致總的組蛋白H3和H4乙?；皆黾?而調(diào)節(jié)組蛋白H3和H4乙?；拿附M蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)和核受體共抑制因子(NCoR)的水平減少。在正常MEF細(xì)胞內(nèi)給予HDAC3特異的阻斷劑可以模擬ataxin-3丟失的情況。綜上所述,的研究首次發(fā)現(xiàn),ataxin-3敲除可導(dǎo)致多種基因轉(zhuǎn)錄異常。Ataxin-3通過調(diào)節(jié)組蛋白去乙酰化酶HDAC3和NCoR的水平來調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的乙?；?進(jìn)而調(diào)