重組慢病毒載體介導(dǎo)的人B區(qū)缺失凝血因子Ⅷ在NOD-SCID小鼠體內(nèi)表達的研究.pdf

1、目的: 包裝人巨細胞病毒立早啟動子(CMV)驅(qū)動的B區(qū)缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因的重組慢病毒載體pXZ208-BDDhFⅧ，觀察其在293T細胞和NOD/SCID小鼠體內(nèi)的表達。 方法: 采用陽離子脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pXZ208-BDDhFⅧ、pXZ171與包裝質(zhì)?！鱊RF、包膜蛋白質(zhì)粒pVSVG共轉(zhuǎn)染293T包裝細胞，包裝后的病毒顆粒體外感染293T細胞。感染72h后逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測BDD-

2、hFⅧ基因的轉(zhuǎn)錄、一期法檢測細胞培養(yǎng)上清FⅧ促凝活性(FⅧ：C)、ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中FⅧ抗原(FⅧ：Ag)、流式細胞儀(FCM)檢測載體的感染效率。感染后的靶細胞傳代培養(yǎng)，PCR檢測BDDhFⅧ基因的整合。超速離心法濃縮病毒顆粒，經(jīng)門靜脈注射途徑感染NOD/SCID小鼠。感染后72h、一周和一月后測定小鼠血漿中FⅧ：Ag。RT-PCR法檢測小鼠肝臟中BDD-hFⅧ基因的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)果: 重組病毒體外感染293T細胞，其

3、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達90％。攜帶BDDhFⅧ基因的慢病毒顆粒感染293T細胞后72h培養(yǎng)上清中FⅧ：C水平為正常水平的(27.4±5.7)％，hFⅧ：Ag水平為(483±26)mU/ml；RT-PCR法檢測到BDDhFⅧ基因的轉(zhuǎn)錄。對照組未檢測到hFⅧ表達及活性。感染后的傳代細胞中有BDDhFⅧ基因的整合。重組病毒顆粒經(jīng)門靜脈感染NOD/SCID小鼠，感染后72h、一周和一月后hFⅧ：Ag分別為(49±6)mU/ml，(54±8)mU/ml和