十二指腸空腸旁路術(shù)對2型糖尿病腎病大鼠腎功能的影響的研究.pdf

1、第一部分:2型糖尿病腎病大鼠模型的建立
　　背景:
　　在世界范圍內(nèi)，糖尿病發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。其中90％以上是2型糖尿病。糖尿病腎病(Diabetes Nephropathy，DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一。在西方人群中已成為終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)最常見的病因。美國腎臟病數(shù)據(jù)系統(tǒng)(USRDS)2012年最新數(shù)據(jù)顯示:在2010年，新增透析患

2、者中，糖尿病腎病患者超過了50％。在我國，糖尿病腎病患病率僅次于慢性腎小球腎炎，排第二位。研究顯示糖尿病病程達(dá)10-20年者50％合并糖尿病腎病，并且已成為糖尿病的主要死亡原因。
　　針對糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)研究大多通過建立動物模型來進(jìn)行，可靠的糖尿病腎病動物模型是研究糖尿病腎病發(fā)生機(jī)制及干預(yù)措施的重要手段。理想的動物模型應(yīng)該具有在任何實驗室均可復(fù)制，又可以模擬人類糖尿病腎病的發(fā)展病程及特點(diǎn)，同時，兼具價格便宜，方便普及的優(yōu)點(diǎn)。

3、
　　糖尿病腎病模型同樣分為1型和2型糖尿病腎病模型。建立2型糖尿病動物模型的方法較多，主要包括自發(fā)性糖尿病模型及化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是最常用藥物。小劑量STZ+高脂飲食是誘導(dǎo)2型糖尿病最常用的方法。大鼠高脂飲食飼養(yǎng)1個月左右形成胰島素抵抗，然后腹腔注射小劑量STZ損傷部分胰島功能。此方法能模擬人2型糖尿病過程，形成非胰島素依賴性糖尿病。另有報道，單腎切除+高脂飲食+小劑量STZ用于

4、糖尿病腎病模型建立。但尚無應(yīng)用于手術(shù)治療糖尿病腎病的實驗研究的報道。
　　為檢驗適合用于糖尿病手術(shù)研究的糖尿病腎病動物模型，我們采用上述兩種方法建立糖尿病大鼠模型，然后根據(jù)其病程自然發(fā)展為糖尿病腎病模型大鼠。篩選成模大鼠進(jìn)行糖尿病手術(shù)干預(yù)，初步了解術(shù)后大鼠死亡率及腎功能改變情況。
　　方法:
　　將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，即對照組、兩聯(lián)組及腎切除兩聯(lián)組。其中對照組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)4周，然后喂養(yǎng)普通飼料。兩聯(lián)組大

5、鼠進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)4周以誘導(dǎo)胰島素抵抗，然后按35mg/kg劑量進(jìn)行一次性腹腔STZ注射。然后普通飼料喂養(yǎng)。三聯(lián)組先行右腎切除，一周后處理同兩聯(lián)組。大鼠于STZ注射后3天尾靜脈測量隨機(jī)血糖，血糖＞16.7mmol/L視為2型糖尿病誘導(dǎo)成功。大鼠繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)至12周。然后分別對兩聯(lián)組及三聯(lián)組大鼠實施十二指腸空腸旁路術(shù)干預(yù)。術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)觀察至16周期間檢測大鼠體重、進(jìn)食量、尿量等一般指標(biāo)，并進(jìn)一步檢測檢測大鼠血糖變化以及血脂、肌酐變化。

6、檢測大鼠尿蛋白排泄率，腎小球濾過率等腎功能指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1.兩聯(lián)組及三聯(lián)組大鼠總體死亡率分別為25％和66.67％，其中實施十二指腸空腸旁路術(shù)后死亡率分別為18.18％及55.56％。
　　2.兩聯(lián)組及三聯(lián)組大鼠STZ誘導(dǎo)DM后均出現(xiàn)明顯體重增長變緩、進(jìn)食量增加、尿量增加血糖升高等糖尿病表現(xiàn)。DJB術(shù)后再次出現(xiàn)一過性體重下降，而后緩慢上升。
　　3.血肌酐第8、12、16周，三聯(lián)組相比對照組可見明顯升高

7、，差異有顯著性(p＜0.05)。三聯(lián)組大鼠血肌酐呈上升趨勢，在第8、12、16周相比實驗初始有顯著性升高(p＜0.05)。兩聯(lián)組及三聯(lián)組大鼠尿肌酐排泄在第12及16周出現(xiàn)下降，與對照組相比差異有顯著性(p＜0.05)。而兩聯(lián)組與三聯(lián)組相比無顯著性差異。
　　4.檢測血總膽固醇及甘油三酯，可見兩聯(lián)組及三聯(lián)組大鼠TG以及TC水平均在第8及12周出現(xiàn)顯著性升高。高于對照組(p＜0.01)。
　　5.檢測尿微量白蛋白排泄率，三聯(lián)組在

8、8周開始出現(xiàn)上升，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)。而兩聯(lián)組則至第12周出現(xiàn)明顯上升，差異有顯著性(p＜0.05)。在第8、12周以及16周（DJB手術(shù)干預(yù)后），三聯(lián)組尿微量白蛋白排泄均高于兩聯(lián)組(p＜0.05)。
　　6.腎小球濾過率檢測發(fā)現(xiàn)兩聯(lián)組及三聯(lián)組大鼠GFR在8周開始出現(xiàn)上升，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。至第12、16周上升明顯。手術(shù)干預(yù)后可見曲線上升變緩，兩聯(lián)組及三聯(lián)組變化趨勢一致。
　　結(jié)

9、論:
　　1.利用高脂飲食輔助小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型技術(shù)成熟，成功率高。利用該方法所建立的2型糖尿病大鼠持續(xù)喂養(yǎng)8周可出現(xiàn)明顯的蛋白尿及腎小球率過濾升高。
　　2.單腎切除配合高脂飲食輔助小劑量STZ腹腔注射后所建立糖尿病模型大鼠在STZ注射后4周即出現(xiàn)糖尿病腎病表現(xiàn)，出現(xiàn)較高的尿蛋白排泄率及腎小球濾過率。該模型比非腎切除者出現(xiàn)糖尿病腎病癥狀早，縮短建模時間。
　　3.兩者均實施DJB手術(shù)干預(yù)后其血

10、糖水平均可得到良好控制。尿蛋白排泄率及腎小球濾過率變化趨勢基本一致。
　　4.三聯(lián)組大鼠實施DJB手術(shù)后死亡率及總體死亡率較高，如應(yīng)用于糖尿病手術(shù)研究尚待進(jìn)一步完善。
　　第二部分:十二指腸空腸旁路術(shù)對2型糖尿病腎病大鼠腎功能的影響
　　前言:
　　糖尿病腎病是糖尿病病人疾病進(jìn)展所出現(xiàn)的臨床綜合征之一，蛋白尿為其典型的臨床表現(xiàn)。在國外，大約30％的新增2型糖尿病患者尿蛋白水平異常，其中約75％的患者患有微量白蛋白

11、尿，25％的患者存在較明顯的糖尿病腎病表現(xiàn)。國內(nèi)研究顯示糖尿病病程達(dá)10-20年者50％合并糖尿病腎病，并且已成為糖尿病的主要死亡原因。
　　足細(xì)胞(podocyte)，是附著與腎小球基底膜(GBM)外側(cè)的腎小囊臟層上皮細(xì)胞，足細(xì)胞損傷往往表現(xiàn)為明顯的蛋白尿。足細(xì)胞的丟失往往是糖尿病腎病早期的病理改變，并預(yù)示著臨床糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展有研究表明，通過藥物和飲食鍛煉等嚴(yán)格的血糖控制能夠延緩微量白蛋白尿的發(fā)展，穩(wěn)定或減少尿蛋白的排泄

12、，并且減慢慢性腎衰竭的進(jìn)展。但治療效果有限，并不能完全阻止糖尿病腎病的進(jìn)展。
　　針對減肥手術(shù)的實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)，減肥手術(shù)在治療肥胖的同時，其合并的糖尿病亦得到緩解。減肥手術(shù)抑或糖尿病手術(shù)在國外臨床上已得到廣泛應(yīng)用。其治療糖尿病的效果已得到肯定。然而，肥胖是慢性腎功能障礙的一個獨(dú)立因素，減肥手術(shù)治療糖尿病的同時帶來體重的下降，而體重下降本身可使腎功能得到改善。所以，減肥手術(shù)本身帶來的腎功能改善原因是多方面的，包括體重、血糖及其他

13、方面的因素。故并不能夠代表糖尿病手術(shù)本身對腎功能的影響。十二指腸空腸旁路術(shù)(Duodenal-Jejunal Bypass，DJB)假設(shè)糖尿病的改善不依賴于手術(shù)的減肥作用，而是手術(shù)本身所致。那么直接將十二指腸及空腸上段曠置，不改變胃容積，同樣可以起到改善糖尿病作用。實驗結(jié)果證實，曠置十二指腸及空腸上段可直接起到控制糖尿病的目的。
　　在本實驗中，我們采用第一部分兩聯(lián)組大鼠的建模方式建立糖尿病腎病大鼠模型，然后實施DJB手術(shù)，并與假

14、手術(shù)及對照組進(jìn)行比較，從而進(jìn)一步對糖尿病手術(shù)后大鼠腎功能的影響進(jìn)行研究。
　　方法:
　　將40只SD大鼠分為兩組，對照組(CON)8只，采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。其余32只作為實驗組給予高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，將該組大鼠禁食過夜(12h)，然后行腹腔注射STZ(按35mg/kg)以誘導(dǎo)高血糖。3天后取尾靜脈血測隨機(jī)血糖。隨機(jī)血糖＞16.7mmol/L者納入下一步實驗組，未達(dá)標(biāo)者再給予10mg/kg一次STZ注射。將實驗組大鼠隨機(jī)分為

15、三組如下:DJB手術(shù)組（DJB組），假手術(shù)組（S-DJB組），糖尿病組（DM組）。8周后分別對DJB和S-DJB組實施手術(shù)干預(yù)，DM和對照組繼續(xù)喂養(yǎng)觀察，不進(jìn)行任何干預(yù)。所有大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)觀察至術(shù)后8周。期間檢測大鼠體重、進(jìn)食量、尿量等一般指標(biāo)，并進(jìn)一步檢測檢測大鼠血糖變化以及血脂、肌酐、胱抑素-C變化。檢測大鼠尿蛋白排泄率，腎小球濾過率等腎功能指標(biāo)。實驗結(jié)束，將大鼠處死，左腎稱重，右腎甲醛固定，進(jìn)一步行病理分析，檢測大鼠腎小球系膜擴(kuò)張率

16、等。然后進(jìn)行免疫組化，檢測大鼠腎小球足細(xì)胞突觸極蛋白表達(dá)率，明確DJB手術(shù)對大鼠腎功能及病理變化的影響。
　　結(jié)果:
　　1.DJB、S-DJB及DM組大鼠體重基本保持一致，只有在手術(shù)干預(yù)后2周內(nèi)，DJB及S-DJB組大鼠出現(xiàn)明顯的體重下降（p＜0.05）。在整個實驗過程中，各個時間點(diǎn)DJB及S-DJB組大鼠進(jìn)食量相比均無顯著性差異。只有在實施手術(shù)干預(yù)后最初2周內(nèi)DJB及S-DJB組與DM組相比出現(xiàn)進(jìn)食量下降，差異有顯著性(

17、p＜0.05)。
　　2.S-DJB和DM組大鼠擁有較高的腎重及腎重/體重比值，與對照組及DJB組相比有顯著性差異（p＜0.05）。但S-DJB和DM組相比以及對照組和DJB組相比差異均無顯著性。
　　3.DJB組大鼠在2周內(nèi)出現(xiàn)血糖水平下降，接近正常水平，其后血糖水平一直保持穩(wěn)定。與S-DJB和DM組相比，差異有顯著性(p＜0.01)。
　　4.實驗結(jié)束測DJB組大鼠總膽固醇及甘油三脂水平均低于對照組、S-DJB和D

18、M組，差異有顯著性(P＜0.05)。血清胱抑素-C水平檢測發(fā)現(xiàn)，實驗結(jié)束時DJB、S-DJB及DM組大鼠血清胱抑素-C水平相比對照組均有明顯下降(P＜0.05)。但DJB組下降幅度要明顯低于S-DJB及DM組大鼠(P＜0.05)。四組大鼠血肌酐水平檢測未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　5.各組大鼠在術(shù)后檢測尿24小時微量白蛋白排泄率呈逐漸上升趨勢。DJB組大鼠較S-DJB及DM組上升較慢。在術(shù)后2、4、6及8周DJB組大鼠尿微量白蛋白排泄率均

19、明顯低于S-DJB及DM組，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　6.DJB、S-DJB及DM組大鼠術(shù)前比較GFR并無顯著性差異，但均高于對照組。術(shù)后均呈先上升后下降趨勢。DJB組大鼠GFR曲線低且平緩，第2、4、6、8周DJB組大鼠GFR水平均明顯低于S-DJB及DM組，有顯著性差異(p＜0.01)。但S-DJB與DM組之間比較并無顯著性差異發(fā)現(xiàn)。
　　7.S-DJB及DM組大鼠平均腎小球面積較對照組及DJB組有明顯增大，差

20、異有顯著性(P＜0.05)。但DJB組及對照組相比，腎小球面積無顯著性差異發(fā)現(xiàn)。而DJB、S-DJB及DM組大鼠腎小球系膜擴(kuò)張率均較對照組有明顯上升，差異有顯著性（P＜0.05）。
　　8.腎小球突觸極蛋白在對照組大鼠腎小球內(nèi)有較高表達(dá)，而在S-DJB及DM組大鼠中均有較大程度的表達(dá)降低。DJB組大鼠突觸極蛋白表達(dá)則處于對照組和S-DJB及DM組之間。低于對照組但高于S-DJB及DM組，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　

21、結(jié)論:
　　1.DJB手術(shù)可使糖尿病腎病模型大鼠24小時尿微量白蛋白排泄率、腎小球濾過率及血清胱抑素-C水平得到改善。
　　2.DJB手術(shù)可改善糖尿病腎病大鼠血清總膽固醇及甘油三酯水平。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示，DJB手術(shù)可抑制糖尿病腎病大鼠腎小球足細(xì)胞的損傷及丟失。
　　4.糖尿病腎病大鼠腎小球系膜擴(kuò)張率在DJB術(shù)后8周時仍未得到明顯改善。
　　5.DJB手術(shù)有可能通過抑制糖尿病腎病大鼠腎小球足細(xì)胞的丟