肝硬化基礎(chǔ)上肝癌的臨床危險(xiǎn)因素分析及肝癌與肝硬化微小RNA差異表達(dá)研究.pdf

1、目的：
　　1.初探新疆地區(qū)肝硬化病因特點(diǎn)及肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生危險(xiǎn)因素，以及肝硬化患者血液生化學(xué)特征。
　　2.篩選乙肝肝硬化肝癌患者肝癌組織與肝硬化組織微小RNA（microRNA，miRNAs，miRNA）差異表達(dá)譜。
　　3.檢測(cè)差異表達(dá)最明顯的miRNA在原發(fā)性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）患者肝癌組織中的表達(dá)。為原發(fā)性肝癌分子機(jī)制研究提供新的思路和途徑，為原發(fā)性肝癌早期診斷提供分子指標(biāo)

2、的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.回顧分析新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院近11年確診的7212例肝硬化住院患者病因構(gòu)成，探討乙型肝炎病毒（hepatitisB virus HBV）感染合并酒精因素、乙肝病毒、丙肝病毒、飲酒、性別、年齡、種族、2型糖尿病對(duì)肝硬化人群肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生的影響；對(duì)乙肝病毒合并酒精因素肝硬化患者與乙肝病毒不合并酒精肝硬化組、酒精性肝硬化組在年齡、性別、民族、肝硬化嚴(yán)重程度、血常規(guī)、生化指標(biāo)的特征進(jìn)行組間

3、比較；
　　2.在7212例肝硬化患者合并原發(fā)性肝癌的1169例患者中，選取行肝癌根治治療的9例患者，取手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)組）及距腫瘤5cm以上的肝硬化標(biāo)本（對(duì)照組）。利用Trizol法提取肝癌組織和配對(duì)的肝硬化組織細(xì)胞中的總 RNA，分光光度計(jì) NanoDropND-1000進(jìn)行定量，變性凝膠電泳分析提取的總RNA質(zhì)量。利用芯片技術(shù)對(duì)提取的RNA經(jīng)microRNA芯片進(jìn)行雜交，結(jié)果經(jīng)掃描讀數(shù)，最后用Significance

4、 Analysis of Microarrays軟件version3.02（SAM）挑選差異表達(dá)基因。選擇篩選出的2個(gè)差異表達(dá)明顯的miRNAs hsa-miR-1269和hsa-miR-199b-3p進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證；
　　3.結(jié)果采用Rral-time PCR法，進(jìn)一步測(cè)定hsa-miR-1269在肝癌組織和肝硬化組織中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.7212例肝硬化病因構(gòu)成前五位分別是乙型肝炎55.1

5、0％，丙型肝炎13.42%，原發(fā)性膽汁性肝硬化9.28%，酒精性6.36%，隱源性9.01%；16.5%發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌，住院期間死亡6.3%，合并糖尿病占總體12.1%。其中3976例乙肝肝硬化患者中24.25%合并酒精因素，合并酒精因素乙肝肝硬化患者、單純乙肝肝硬化組和酒精性肝硬化患者相比，在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞體積、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、血清尿酸水平呈現(xiàn)出酒精性肝病特征，且均值水平高于單純乙肝肝硬化組；HBV感染、HCV感染、飲酒、

6、男性、高齡為本組肝硬化患者肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而民族（維吾爾族、其他民族與漢族相比）、2型糖尿病未增加本組肝硬化患者肝癌的發(fā)生。
　　2.miRNAs在肝硬化肝癌患者肝癌組織與肝硬化組織中的差異表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異表達(dá)的miRNAs共有15個(gè)，分別為hsa-miR-1269，hsa-miR-18a，hsa-miR-1180，hsa-miR-1301，hsa-miR-182，hsa-miR-222，hsa-miR-36

7、2-5p，hsa-miR-99a，hsa-miR-10a，hsa-miR-30a，hsa-miR-30e，hsa-miR-139-5p，hsa-miR-422a，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-199b-3p。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果：hsa-miR-1269在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的平均表達(dá)豐度分別為12.058±3.954和16.678±2.352，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.008）。hsa-miR-199b-3p在實(shí)

8、驗(yàn)組和對(duì)照組中的平均表達(dá)豐度分別為5.417±1.633和3.033±0.768，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.001）。hsa-miR-1269在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，hsa-miR-199b-3p在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，與miRNAs微陣列芯片結(jié)果一致。
　　3.hsa-miR-1269在肝硬化肝癌患者肝癌組織和肝硬化中的表達(dá)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果：hsa-miR-1269在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的平均表達(dá)豐度分別為12.634±4.0

9、04和16.963±1.832，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.新疆地區(qū)乙型肝炎病毒感染是該地區(qū)肝硬化主要原因，但酒精因素與 HBV重疊較普遍是其特征；HBV合并酒精因素肝硬化組較乙肝肝硬化組面臨更高的氧化應(yīng)激壓力，間接提示酒精因素的參與可能增加乙肝感染者發(fā)生肝硬化的機(jī)會(huì)；HBV感染、HCV感染、酒精（包括飲酒史不詳者）、男性、高齡為該組肝硬化患者HCC獨(dú)立危險(xiǎn)因素。民族及2型糖尿病并未增加肝硬化

10、患者肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生；
　　2.在乙肝肝硬化肝癌患者肝癌組織與肝硬化組織中篩選出了15種差異表達(dá)的miRNAs，其中 hsa-miR-1180，hsa-miR-1301在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，而hsa-miR-1269和hsa-miR-10a與其他一些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但未見(jiàn)在肝癌中的報(bào)道；
　　3.在15種差異表達(dá)的miRNAs中，hsa-miR-1269在肝硬化肝癌患者肝癌組織中呈明顯的高表達(dá)，是一種功能上類似促癌基