MicroRNA-29b和microRNA-132對(duì)CD4+T細(xì)胞活化的調(diào)控及其在SLE發(fā)病中的作用研究.pdf

1、第一部分 SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜及靶基因預(yù)測(cè)
　　目的:檢測(cè)SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞中miRNA的表達(dá)情況，并對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能分析。
　　方法:高通量qPCR方法分別檢測(cè)9例SLE患者和9例正常對(duì)照外周血CD4+T細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，TargetScan/miRanda/PicTar等靶基因預(yù)測(cè)軟件和go-pathway分析對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能

2、分析。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，SLE患者CD4+T細(xì)胞中存在29種表達(dá)異常的miRNA，其中表達(dá)上調(diào)有miR-1302，-320a，-126，-3200，-107，-29b，-1260，-1913，-451，-98，-3125，-132，-744，-21，-606，-3190-5p16種，表達(dá)下調(diào)有miR-3926，-4311,-7-2*,-1253,-633,-1279,-3201,-558,-620,-664,-609,

3、-3148,-488*13種。29種miRNA的預(yù)測(cè)靶基因中，221個(gè)基因可能與SLE發(fā)病相關(guān)。其中調(diào)控DNMT1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子sp1可能是miR-29b的潛在靶基因，MeCP2可能是miR-132的潛在靶基因。
　　結(jié)論:SLE患者CD4+T細(xì)胞中存在多個(gè)miRNA表達(dá)異常，可能在SLE發(fā)病中起著重要作用。sp1可能是miR-29b的潛在靶基因，MeCP2可能是miR-132的潛在靶基因。
　　第二部分 miR-29b靶向

4、調(diào)控sp1影響DNMT1和DNA甲基化水平參與SLE發(fā)病
　　第一節(jié) miR-29b在SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證miR-29b在SLE患者CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法:實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)36例SLE患者和28例正常對(duì)照CD4+T細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平，并分析其與sp1和DNMT1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:miR-29b在SLE患者CD4+T

5、細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與sp1和DNMT1蛋白水平均呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.551，P=0.018和r=-0.629，P=0.005）。
　　結(jié)論:miR-29b異常表達(dá)可能通過(guò)影響sp1和DNMT1水平參與SLE發(fā)病。
　　第二節(jié) miR-29b通過(guò)靶向抑制sp1影響DNMT1表達(dá)的驗(yàn)證
　　目的:驗(yàn)證sp1調(diào)控DNMT1表達(dá);miR-29b通過(guò)靶向抑制sp1間接調(diào)控DNMT1的表達(dá)。
　　方法:體外設(shè)計(jì)合

6、成sp1-siRNA/陰性對(duì)照和miR-29b mimics/陰性對(duì)照，nucleofector核酸轉(zhuǎn)染儀將sp1-siRNA和陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞或人原代外周血CD4+T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR和western-blot檢測(cè)sp1和DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)情況;同樣，通過(guò)nucleofector核酸轉(zhuǎn)染儀將miR-29b mimics和陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞或人原代外周血CD4+T細(xì)

7、胞，48h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR和western-blot檢測(cè)sp1和DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:在Jurkat細(xì)胞中:與對(duì)照組比較，sp1-siRNA轉(zhuǎn)染組sp1和DNMT1 mRNA（P＜0.005和P＜0.01）和蛋白的表達(dá)水平均明顯降低;miR-29b mimics轉(zhuǎn)染組sp1和DNMT1 mRNA（P＜0.005和P＜0.01)和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組也均顯著降低。在人原代CD4+T細(xì)胞中，與對(duì)

8、照組比較，sp1-siRNA轉(zhuǎn)染組sp1和DNMT1 mRNA（P均＜0.05）和蛋白的表達(dá)水平均明顯下降;miR-29b mimics轉(zhuǎn)染組sp1和DNMT1mRNA（P均＜0.05）和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組也均顯著下降。
　　結(jié)論:sp1能夠調(diào)控DNMT1表達(dá)，miR-29b可能通過(guò)與靶基因sp1 mRNA結(jié)合引起其降解從而降低sp1蛋白水平間接影響DNMT1表達(dá)。
　　第三節(jié)過(guò)表達(dá)miR-29b誘導(dǎo)正常人CD4+T細(xì)胞

9、自身過(guò)度活化
　　目的:觀察誘導(dǎo)miR-29b過(guò)表達(dá)對(duì)正常人CD4+T細(xì)胞DNA甲基化水平，自身免疫相關(guān)甲基化敏感基因表達(dá)的影響。
　　方法:體外設(shè)計(jì)合成miR-29b mimcs和陰性對(duì)照，采用nucleofector核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染正常人外周血CD4+T細(xì)胞，基因組甲基化水平檢測(cè)試劑盒檢測(cè)基因組DNA甲基化水平，HRM-PCR檢測(cè)CD11a、CD70基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD11a和

10、CD70基因mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:與陰性對(duì)照組比較，miR-29b mimics轉(zhuǎn)染組基因組DNA甲基化水平顯著降低（P＜0.05），CD11a、CD70啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平也均明顯降低（P均＜0.05），CD11a和CD70基因mRNA水平（P均＜0.05）和蛋白水平(P＜0.005和P＜0.05)均顯著升高。
　　結(jié)論:miR-29b過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制正常人CD4+T細(xì)胞DNMT1表達(dá)誘導(dǎo)DNA低甲基化，從而促

11、使CD11a、CD70過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致T細(xì)胞過(guò)度活化。
　　第四節(jié)干擾miR-29b表達(dá)抑制SLE CD4+T細(xì)胞自身過(guò)度活化
　　目的:觀察抑制miR-29b表達(dá)對(duì)SLE患者CD4+T細(xì)胞DNA甲基化水平、自身免疫相關(guān)甲基化敏感基因表達(dá)的影響。
　　方法:體外設(shè)計(jì)合成miR-29b inhibitor和陰性對(duì)照，采用nucleofector核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞，RT-PCR和western-

12、blot檢測(cè)sp1和DNMT1基因mRNA和蛋白水平，基因組甲基化水平檢測(cè)試劑盒檢測(cè)基因組DNA甲基化水平，HRM-PCR檢測(cè)CD11a、CD70基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD11a和CD70基因mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:與陰性對(duì)照組比較，miR-29b inhibitor轉(zhuǎn)染組CD4+T細(xì)胞中sp1和DNMT1mRNA（P均＜0.05）和蛋白的表達(dá)水平均有顯著升高，基因組DNA甲基化水平和CD

13、11a、CD70啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平也均顯著升高（P均＜0.05），CD11a和CD70基因mRNA水平（P均＜0.05）和蛋白水平（P均＜0.05）均明顯降低。
　　結(jié)論:干擾miR-29b表達(dá)能夠通過(guò)上調(diào)sp1和DNMT1水平，在一定程度上逆轉(zhuǎn)SLE患者CD4+T細(xì)胞甲基化水平，從而降低CD11a、CD70的表達(dá)抑制T細(xì)胞過(guò)度活化，緩解自身免疫反應(yīng)。
　　第三部分 microRNA-132靶向調(diào)控MeCP2影響甲基化敏感

14、基因表達(dá)參與SLE發(fā)病
　　第一節(jié) miR-132在SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證miR-132在SLE患者CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法:實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)36例SLE患者和28例正常對(duì)照CD4+T細(xì)胞中miR-132的表達(dá)水平，并分析其與MeCP2蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:miR-132在SLE患者CD4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與MeCP2蛋白

15、水平呈顯著負(fù)相關(guān)（（r=-0.872，P＜0.001）。
　　結(jié)論:miR-132異常表達(dá)可能通過(guò)影響MeCP2水平參與SLE發(fā)病。
　　第二節(jié) miR-132靶向作用MeCP2的驗(yàn)證
　　目的:驗(yàn)證MeCP2是miR-132的靶基因。
　　方法:體外設(shè)計(jì)合成miR-132 mimics和陰性對(duì)照，通過(guò)nucleofector核酸轉(zhuǎn)染儀將miR-132 mimics和陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞或人原代外

16、周血CD4+T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR和western-blot檢測(cè)MeCP2 mRNA和蛋白表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增獲得MeCP23'-UTR片段，克隆到psicheck-2表達(dá)載體，構(gòu)建MeCP2野生型熒光素酶重組載體，同時(shí)采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建MeCP2突變型熒光素酶重組載體，分別與miR-132 mimics和陰性對(duì)照用脂質(zhì)體法瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，以海腎熒光

17、素酶作為內(nèi)參照，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性。
　　結(jié)果:在Jurkat細(xì)胞和人原代CD4+T細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，miR-132 mimics轉(zhuǎn)染組MeCP2 mRNA的表達(dá)水平均無(wú)顯著變化（P均＞0.05），MeCP2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低;在Jurkat細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-132 mimics，可以抑制MeCP2野生型熒光素酶重組載體熒光素酶的活性(P＜0.05)，但不能抑制MeCP2突變型熒光素酶重組載體熒光素酶的活性（P＞

18、0.05）。
　　結(jié)論:MeCP2是miR-132的靶基因，miR-132通過(guò)作用于靶基因MeCP23'-UTR區(qū)抑制其翻譯從而降低MeCP2蛋白的水平。
　　第三節(jié)過(guò)表達(dá)miR-132誘導(dǎo)正常人CD4+T細(xì)胞自身過(guò)度活化
　　目的:觀察誘導(dǎo)miR-132過(guò)表達(dá)對(duì)正常人CD4+T細(xì)胞中自身免疫相關(guān)甲基化敏感基因表達(dá)的影響。
　　方法:體外設(shè)計(jì)合成miR-132 mimics和陰性對(duì)照，采用nucleofector

19、核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染正常人外周血CD4+T細(xì)胞，染色體免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)MeCP2蛋白與CD11a、CD70啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合量，HRM-PCR檢測(cè)CD11a和CD70基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD11a和CD70基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與陰性對(duì)照組比較，miR-132 mimics轉(zhuǎn)染組CD4+T細(xì)胞MeCP2蛋白與CD11a和CD70啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合水平顯著降低（P＜0.005

20、和P＜0.05），但CD11a和CD70基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平均無(wú)明顯改變（P均＞0.05），CD11a和CD70基因mRNA水平（P均＜0.05）和蛋白水平（P均＜0.05）均顯著升高。
　　結(jié)論:miR-132可能通過(guò)降低MeCP2蛋白水平導(dǎo)致MeCP2與CD11a、CD70啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合量減少，使得其對(duì)基因表達(dá)的沉默作用下降，促使CD11、CD70過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞過(guò)度活化。
　　第四節(jié)干擾miR-132表達(dá)抑制

21、SLE CD4+T細(xì)胞自身過(guò)度活化
　　目的:觀察抑制miR-132表達(dá)對(duì)SLE患者CD4+T細(xì)胞中自身免疫相關(guān)甲基化敏感基因表達(dá)的影響。
　　方法:體外設(shè)計(jì)合成miR-132 inhibitor和陰性對(duì)照，采用nucleofector核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞，western-blot檢測(cè)MeCP2蛋白的表達(dá)水平，染色體免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)MeCP2蛋白與CD11a、CD70啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合量，

22、HRM-PCR檢測(cè)CD11a和CD70基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平， RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD11a和CD70基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與陰性對(duì)照組比較，miR-132 inhibitor轉(zhuǎn)染組CD4+T細(xì)胞中MeCP2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，MeCP2蛋白與CD11a和CD70啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合水平較陰性對(duì)照組明顯升高（P均＜0.05），但CD11a、CD70啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平無(wú)顯著改變（P均＞0.05），C