microRNA-29b通過調(diào)控賴氨酰氧化酶對(duì)人卵巢透明細(xì)胞癌增殖和侵襲的影響.pdf

1、研究背景:
　　卵巢癌是婦科常見的生殖道惡性腫瘤，死亡率居?jì)D科腫瘤之首，嚴(yán)重威脅了廣大女性的健康和生命。疾病的早期診斷困難以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移所致的治療手段缺乏，是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因。卵巢透明細(xì)胞腫瘤是上皮性卵巢腫瘤中的一種，絕大部分為惡性腫瘤，約占卵巢上皮性癌的5％，在東方女性中較西方更為常見。卵巢透明細(xì)胞癌雖較少見，但因具有對(duì)化療不敏感、易耐藥、早期復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點(diǎn)，引起了婦科腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。
　　賴氨酰氧

2、化酶(Lysyl oxidase，LOX)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中催化膠原與彈性蛋白聚合的關(guān)鍵酶。研究表明LOX可調(diào)節(jié)細(xì)胞移動(dòng)，參與基因調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、生長調(diào)控及促使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化等。近期研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞的分化、生長控制、黏附性、活性、惡性轉(zhuǎn)化及侵襲性等均與細(xì)胞外基質(zhì)中LOX的異常表達(dá)密切相關(guān)。目前認(rèn)為LOX可能具有雙重作用，既是腫瘤抑制因子，同時(shí)也很可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因子

3、。之前很多文獻(xiàn)報(bào)道LOX在不同類型的腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中的表達(dá)出現(xiàn)紊亂，令人感興趣的是，LOX在不同類型腫瘤中表達(dá)改變也不相同，在病理狀態(tài)下LOX的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的情況均有報(bào)道。然而，LOX在卵巢癌中，尤其是卵巢透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能仍不明確。
　　microRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA，通過促進(jìn)靶基因mRNA降解和（或）抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。microRNA的異常表達(dá)與腫

4、瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其異常表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖、凋亡抑制，并促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞間質(zhì)重塑和腫瘤血管生成的重要因素。研究表明microRNA具有很好的組織特異性，并且其表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段也具有差異性，這提示我們可以使用microRNA作為腫瘤早期診斷及病情監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物。近年來，關(guān)于卵巢癌中microRNA功能的研究越來越多。結(jié)論表明，多種microRNA參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。有些是作為原癌基因發(fā)揮促

5、進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移的作用，而有些則作為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。
　　通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)miR-29b可能是能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控LOX的microRNA。現(xiàn)有研究表明，miR-29b的表達(dá)在乳腺癌，肝癌，前列腺癌等多種腫瘤中均呈不同程度下調(diào)，并且參與了結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌發(fā)展的早期過程，提示miR-29b在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能作為抑癌因子發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-29家族與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，通過誘

6、導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)乳腺癌和結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，也可在膽管癌細(xì)胞中通過抑制Mcl-1的表達(dá)增加細(xì)胞對(duì)TRAIL的凋亡敏感性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前miR-29的研究已涉及多種腫瘤，microRNA表達(dá)譜顯示，miR-29在卵巢癌中失調(diào)表達(dá)，但其發(fā)揮生物學(xué)功能的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。
　　綜上所述，研究LOX在卵巢透明細(xì)胞癌中的功能，篩選出在卵巢透明細(xì)胞癌中能夠?qū)OX作為靶基因的microRNA，并探究其發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)

7、制，將為LOX有可能成為卵巢透明細(xì)胞癌治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　(1)檢測(cè)卵巢透明細(xì)胞癌組織、癌旁組織以及多種卵巢癌的細(xì)胞系中LOX的表達(dá)。
　　(2)檢測(cè)過表達(dá)LOX對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響，確定LOX的生物學(xué)功能。
　　(3)篩選并證實(shí)在卵巢透明細(xì)胞癌中能夠調(diào)控LOX的microRNA，并分析其與LOX表達(dá)量之間的關(guān)系。
　　(4)檢測(cè)miR-29b異

8、常表達(dá)對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。
　　研究方法:
　　1.收集27例外科切除手術(shù)所得的卵巢透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織標(biāo)本，使用免疫組化法對(duì)癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本中LOX的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析不同組織中LOX的陽性表達(dá)率，進(jìn)行分析。此外，體外培養(yǎng)多種卵巢癌細(xì)胞系，例如人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2，人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞OV-1063，人卵巢腺癌細(xì)胞SKOV3和人卵巢腺癌細(xì)胞OVCAR-3，以正常卵巢

9、上皮細(xì)胞為陰性對(duì)照，使用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中LOX的蛋白表達(dá)水平。
　　2.將LOX的編碼區(qū)構(gòu)建到pcDNA3骨架質(zhì)粒上，建立pcDNA3-LOX過表達(dá)質(zhì)粒，并將該過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ES-2細(xì)胞中，用Western blot法驗(yàn)證過表達(dá)效率。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒24小時(shí)(24 h)、48小時(shí)(48 h)和72小時(shí)(72 h)后，使用CCK-8法檢測(cè)過表達(dá)LOX對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒48 h

10、后，使用Transwell法檢測(cè)過表達(dá)LOX對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　3.通過生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan尋找并篩選可能的microRNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)ES-2，OV-1063，SKOV3和OVCAR-3幾種卵巢癌細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，并與LOX的表達(dá)譜進(jìn)行比較，進(jìn)一步明確miR-29b與LOX表達(dá)之間的關(guān)系。將LOX基因mRNA3'UTR區(qū)構(gòu)建到pMIR-REPORTTM質(zhì)粒上形成Luc-LOX

11、3'UTR WT質(zhì)粒，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，并將Luc-LOX3'UTRWT質(zhì)粒上與miR-29b互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)進(jìn)行突變，成為Luc-LOX3'UTR Mut質(zhì)粒，與正常的Luc-LOX3'UTR質(zhì)粒組進(jìn)行比較，明確LOX是否為miR-29b的靶基因。使用Western blot法檢測(cè)改變miR-29b的表達(dá)水平是否能夠影響內(nèi)源性LOX蛋白的表達(dá)水平。
　　4.將miR-29b激動(dòng)劑Mimics、miR-29b抑制劑Inhibit

12、or以及陰性對(duì)照Scramble轉(zhuǎn)染至ES-2細(xì)胞中，并用實(shí)時(shí)定量PCR法驗(yàn)證過表達(dá)和敲低效率。使用CCK-8法檢測(cè)Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細(xì)胞增殖能力的改變。使用Transwell法檢測(cè)Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　1.檢測(cè)卵巢透明細(xì)胞癌、癌旁組織及多種卵巢癌細(xì)胞系中LOX的表達(dá):
　　1.1免疫組化檢測(cè)卵巢透明細(xì)胞癌

13、、癌旁組織中LOX的表達(dá):
　　卵巢透明細(xì)胞癌癌旁組織中可以檢測(cè)到明顯的LOX表達(dá)，而卵巢透明細(xì)胞癌組織中均未檢測(cè)到強(qiáng)表達(dá)。LOX陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，27例卵巢透明細(xì)胞癌癌旁組織中表達(dá)陽性23例(85.2％)，表達(dá)陰性為4例(14.8％)。而在卵巢透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)陽性3例(11.1％)，表達(dá)陰性為23例(88.9％)。
　　1.2 Westernblot法檢測(cè)多種卵巢癌細(xì)胞系中LOX的表達(dá):
　　在正常卵巢上皮細(xì)

14、胞中，LOX蛋白呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。在人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2，人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞OV-1063，人卵巢腺癌細(xì)胞SKOV3和人卵巢腺癌細(xì)胞OVCAR-3中LOX蛋白表達(dá)水平則明顯降低。
　　2.LOX過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后細(xì)胞增殖、侵襲能力的變化:
　　轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒24小時(shí)(24h)、48小時(shí)(48h)和72小時(shí)(72 h)后，ES-2細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制。轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后，ES-2細(xì)胞的

15、侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。
　　3.熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及Western blot驗(yàn)證miR-29b對(duì)LOX表達(dá)的調(diào)控:
　　ES-2中miR-29b出現(xiàn)異常高表達(dá)，而OV-1063、SKOV3和OVCAR-3中miR-29b未見有異常表達(dá)。將Luc-LOX3'UTR WT與Luc-LOX3'UTR Mut分別轉(zhuǎn)染至ES-2和SKOV3巾，miR-29b表達(dá)較高的ES-2細(xì)胞中，Mut組熒光素酶活性較

16、WT組明顯升高;而在miR-29b表達(dá)較低的SKOV3細(xì)胞中，Mut組和WT組熒光素酶活性大致相等。將Luc-LOX3'UTR WT與Luc-LOX3'UTRMut分別轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，再同時(shí)過表達(dá)miR-29b，則Luc-LOX3'UTR WT組中過表達(dá)miR-29b能夠有效地降低熒光素酶活性，而Luc-LOX3'UTR Mut組中則無明顯改變。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。
　　4.miR-29b過表達(dá)及敲除實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mi

17、R-29b對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響:
　　轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-29b過表達(dá)和敲低體系。CCK-8法結(jié)果顯示，Mimics組細(xì)胞增殖能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。Transwell法結(jié)果顯示，Mimics組細(xì)胞侵襲能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。