紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒制備和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究.pdf

1、惡性腫瘤和癌癥一直以來都威脅著人類的生命,使得許多的科學家們都致力于惡性病的研究和防治工作。然而目前對于惡性血液病、腫瘤等的治療方案只對部分病人有效,而治療失敗有可能是多種因素造成的,其中最主要的一個因為是靶細胞對化療藥物的耐受性,是影響化療療效的主要障礙。早在二十年前,人們發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞一旦對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性,通常會對其它結(jié)構(gòu)、功能、作用位點不同的化療藥物也產(chǎn)生抗性,即多藥耐藥性。
　　 隨著對MDR機理的深入了解,越來

2、越多學者把目光投向?qū)ふ肄卓够蚰孓D(zhuǎn)腫瘤細胞MDR。早期研究主要集中在小分子逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞MDR,如維拉帕米、環(huán)孢霉素A、三氟拉嗪等化學增敏劑,現(xiàn)在又有第二、第三代逆轉(zhuǎn)劑相繼被發(fā)現(xiàn)。但此類藥物有明顯心、腎毒性,故很少應用于臨床。近年來人們轉(zhuǎn)向其它途徑尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞MDR的有效方法。實驗證明,將抗腫瘤藥物連結(jié)在納米粒子上,不僅可以提高藥物抗癌的功效,抵御多藥耐藥性,還可以減小藥物對正常組織的不良反應,增強藥物的選擇性。
　　 納

3、米粒子是一種微觀膠質(zhì)體系,其粒徑一般<1μm,由納米微球和納米微囊構(gòu)成。納米微囊是囊性系統(tǒng),藥物分布在囊膜上的獨立小孔中。納米粒子可以穿過組織間隙、毛細血管,通過血腦屏障及組織內(nèi)皮細胞,將藥物在細胞或亞細胞的水平上釋放。作為腫瘤藥物輸送系統(tǒng),納米粒子具有緩釋藥物、靶向輸送、減少劑量、保證藥效并減輕毒副反應的作用。
　　 目前藥學中用作藥物載體的材料很多,包括脂質(zhì)體、多糖類、高分子聚合物等。聚氰基丙烯酸烷酯(Polyalkylcy

4、anocraylate,PACA)由于可生物降解及其在外科臨床應用中的安全性而成為應用較早也較成熟且具有前景的納米材料,已報道的有氰基丙烯酸甲酯(MCA)、氰基丙烯酸乙酯(ECA)、氰基丙烯酸正丁酯(BCA)、氰基丙烯酸異丁酯(IBCA)等,隨著烷基鏈的延長,生物降解速度逐漸減慢。經(jīng)過近30年的發(fā)展,證實聚氰基丙烯酸烷酯納米粒(PACA-NP)較其它納米載體有較好的被動肝靶向性、制劑的穩(wěn)定性等諸多優(yōu)點,經(jīng)表面修飾后可成為長效制劑,還可制

5、成主動靶向和物理化學靶向制劑。而且證實PACA-NP是目前少數(shù)可通過血腦屏障(BBB)的納米粒之一,甚至空白的PACA-NP還可以與藥物起協(xié)同作用。還有,PACA-NP是目前唯一被認為有可能對MDR逆轉(zhuǎn)有效的納米粒載體。
　　 植物藥紫杉醇(paclitaxel,PTX,商品名Taxol)是具有明顯抗腫瘤特性的二萜酰胺類化合物,作為應用于臨床的新型藥物,目前已成為肺癌、乳腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤等常見惡性腫瘤的一線用藥,其療效也

6、已在臨床實踐中得以證實,也是腫瘤晚期仍行之有效的化療藥物。目前,市場上已有注射劑,由于其水溶性差,臨床上使用的助溶劑為聚氧乙烯蓖麻油/無水乙醇(50:50)制成的無色黏稠狀濃溶液,由此極易導致嚴重的過敏反應以及腎毒性和神經(jīng)毒性等不良反應。
　　 本課題設想研究設計紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯(Paclitaxel-loadedpolybutylcyanoacrylate nanoparticles,PTX-PBCA-NPs),一方面

7、利用載體包裹脂溶性藥物紫杉醇,避免使用聚氧乙烯蓖麻油,降低毒副作用,提高生物利用度。另一方面旨在尋找一種新型的高分子材料作為難溶性抗癌藥物給藥系統(tǒng)的載體,并能逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR現(xiàn)象。
　　 基于以上目的,本文主要進行以下幾個方面的研究。
　　 首先進行PTX-PBCA-NPs處方前研究,包括建立PTX-PBCA-NPs中PTX的HPLC含量測定方法、包封率和載藥量測定方法。在此基礎上,通過以粒徑、分散系數(shù)和載藥量為評價指標,

8、比較PTX-PBCA-NPs的制備方法,最終確定界面縮聚法優(yōu)于乳化聚合法(P<0.05)。進行PTX-PBCA-NPs的處方設計和制備工藝研究,以粒徑、包封率和載藥量為指標,通過對右旋糖酐(Dextran 70)、卵磷脂、PTX用量、BCA單體濃度、有機溶劑的選擇、水相的PH值和有機相與水相比例不同進行單因素考察,確定處方；通過正交設計優(yōu)化處方和制備工藝。制備的PTX-PBCA-NPs(n=3)粒徑為(226.93±11.95)nm,包

9、封率為(95.72±0.08)％,載藥量為(0.8±0.07)％。
　　 對PTX-PBCA-NPs的理化性質(zhì)進行系統(tǒng)考察,主要包括形態(tài)學、穩(wěn)定性和釋放考察等等。結(jié)果表明,PTX-PBCA-NPs外觀為乳白色液體,質(zhì)地細膩,色澤均勻,流動性好。通過掃描電鏡觀察,制得的納米粒外觀圓整,大小較均一,分散性好,其平均粒徑在100 nm～200 nm范圍內(nèi),比粒度分析儀測定的結(jié)果偏低。粒度分析儀測得PTX-PBCA-NPs的平均粒徑在2

10、00nm左右,呈單峰分布。將PTX-PBCA-NPs置于4℃冰箱放置,考察其粒徑以及載藥量的變化。從放樣穩(wěn)定性考察結(jié)果可以看出,PTX-PBCA-NPs在4℃條件下,粒徑變化不大；但放置1個月后,開始有藥物滲漏,載藥量降低,放置2個月后,載藥量急劇降至原來的一半,其因為可能是被包裹的藥物在溶液中擴散所至,說明液體劑型不適于制劑的保存與使用,應將液體劑型凍干。采用動態(tài)透析法,以PH 7.4的磷酸鹽緩沖液為釋放介質(zhì),37℃條件下,100 r

11、pm進行體外釋藥試驗；實驗表明所制備的NPs具有一定的緩釋特點。運用不同的數(shù)學模型:Higuchi、Niebergull、Monoexoonential、Weibull及Hixcon-Crowell模型對納米粒的累積釋放度數(shù)據(jù)進行擬合。在本實驗中,比較各濃度納米組的數(shù)學擬合模型,以Weibull分布函數(shù)擬合度最高(R2=0.926),提示各濃度納米組能夠表現(xiàn)出較為一致的釋藥行為,所以Weibull模型方程可以最好地擬合本實驗的體外釋放曲

12、線。
　　 進一步觀察空白聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的細胞毒性,選用L-02人正常肝細胞、A2780和A2780/T細胞進行毒性實驗,以MTT和乳酸脫氫酶(LDH)活性指標考察空白納米粒的生物相容性。實驗表明,用丙酮制備的空白PBCA-NPs在一定范圍內(nèi)對A2780和A2780/T細胞可認為無細胞毒性,但一旦濃度大于304ng/ml,對細胞有明顯毒性；用乙醇制備的空白PBCA-NPs濃度大于38ng/ml,對人卵巢癌細胞毒性明顯。

13、因此,用丙酮作為溶劑制備的空白PBCA-NPs毒性大于用乙醇制備的。制備的空白PBCA-NPs只有在大于608ng/ml時,對于L-02細胞具有明顯的毒性(P<0.05)。而空白PBCA-NPs組對A2780和A2780/T細胞的細胞存活率影響,在濃度304～608ng/ml范圍內(nèi),與對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 為探討PTX-PBCA-NPs逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的機制,采用A2780和A2780/T細胞進行細胞

14、實驗。通過RT-PCR實驗可知,A2780/T細胞中MDR1基因表達明顯高于A2780細胞中MDR1基因表達,有顯著性差異(P<0.05)。表明,這兩株細胞可用于研究P-gp介導的細胞多藥耐藥性,為逆轉(zhuǎn)耐藥提供依據(jù)。藥敏實驗結(jié)果顯示,紫杉醇(PTX)溶液作用早期(作用24h),A2780/T細胞顯示其藥物耐受性,對A2780/T無生長抑制作用。在PTX溶液作用中期與后期(48、72h),A2780細胞較A2780/T細胞更為敏感。而且在

15、一定劑量范圍內(nèi)(3.125～400μg/ml),隨著PTX藥物劑量的增加和時間延長,A2780細胞和A2780/T細胞抑存活率均逐漸降低,具有劑量和時間依賴性；得到A2780/T細胞對PTX耐藥指數(shù)在48h時達到149倍,在72h時達到304倍。通過細胞毒實驗可知,PTX-PBCA-NPs與同一濃度的PTX原料藥相比,對A2780的細胞存活率明顯降低。當PTX濃度在9.5～608 ng/ml之間時,差異顯著(P<0.05)。因此,排除納

16、米材料毒性,在9.5～152 ng/ml之間時,PTX-PBCA-NPs抑制A2780細胞增殖效果顯著高于PTX溶液組。而對于A2780/T細胞的結(jié)果表明,當PTX濃度在38～608 ng/ml之間時,PTX-PBCA-NPs與同一濃度的PTX原料藥相比,對細胞存活率明顯降低,有顯著性差異(P<0.05)。因此,排除納米材料毒性,在38～76 ng/ml之間時,PTX-PBCA-NPs抑制A2780/T細胞增殖效果顯著高于PTX溶液組。

17、由細胞毒實驗結(jié)果計算出的數(shù)據(jù)表明,對于A2780和A2780/T細胞,PTX-PBCA-NPs較PTX溶液毒性明顯增強(P<0.05)。因此,PTX-PBCA-NPs在低濃度(38～76 ng/ml)時,對A2780/T細胞的抑制作用大于對A2780細胞的;而且PTX-PBCA-NPs比同一濃度的PTX溶液對細胞具有更強的殺傷力。
　　 綜上所述,本課題采用界面縮聚法制備的PTX-PBCA-NPs粒徑大小、分布合適,電鏡下觀察為

18、圓形,均一性較好。由于PTX水溶性差,載藥量不是很高。體外釋藥研究證實制備的PTX-PBCA-NPs具有一定的緩釋特性并符合Weibull模型。細胞毒性實驗表明,制備的空白PBCA-NPs只有在大于608ng/ml時,對于L-02細胞具有明顯的毒性；而在濃度304～608ng/ml范圍內(nèi),空白PBCA-NPs組對A2780和A2780/T細胞具有明顯毒性。還有,PTX-PBCA-NPs在低濃度(38～76 ng/ml)時,對A2780/