姜黃素對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞Wnt-β-catenin信號通路影響的離體研究.pdf

1、目的:
　　隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人口的不斷老齡化,中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險因素如高血壓、糖尿病、外傷等因素逐年增加,中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的發(fā)病率表現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢,CNS疾病具有致殘率高、致死率高等特點,給社會和家庭都帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和沉重的心理負(fù)擔(dān)。目前,手術(shù)、基因及康復(fù)治療等方法已被用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,雖然這些方法具有諸多優(yōu)越性,但大部分患者仍不能取得實質(zhì)性的功能恢復(fù)。因此,CNS損傷的有效治療方法亟待解決。CNS損傷后,

2、損傷區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)在刺激因素的作用下不斷增殖,且可以在刺激因素下向不同的神經(jīng)細(xì)胞分化,包括星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte Ast)、神經(jīng)元(neuron N)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte Olig),而神經(jīng)干細(xì)胞向這三者,尤其是向神經(jīng)元細(xì)胞分化的比例,則在很大程度上決定了CNS損傷患者的預(yù)后。中藥姜黃在印度及我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛,姜黃素(Curcumin)是姜黃的

3、提取物,為多酚類物質(zhì),具有多種生物活性而幾乎無副作用,姜黃素臨床應(yīng)用的關(guān)鍵是闡明其作用機制。之前的大量研究已證明姜黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用及促分化作用。Kim等研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在500nmol/L時其神經(jīng)保護(hù)作用最強。激活 Wnt/β-catenin信號通路能顯著促進(jìn)成年動物海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的分化比例,在調(diào)控成年動物大腦中的神經(jīng)再生中起關(guān)鍵性作用,目前已經(jīng)明確wnt3a、β-catenin屬于經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通

4、路,在神經(jīng)發(fā)育中有重要作用。目前,尚無文獻(xiàn)報道在神經(jīng)干細(xì)胞中,姜黃素與經(jīng)典的 Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系。本實驗通過設(shè)計不同的干預(yù)條件,觀察各干預(yù)組對神經(jīng)干細(xì)胞中Wnt信號通路的影響,利用Western blot、RT-PCR手段檢測Wnt信號通路中wnt3a、β-catenin蛋白及wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá)水平的變化,以此探索姜黃素與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路之間的關(guān)系。本實驗試圖揭示姜

5、黃素神經(jīng)保護(hù)的可能機制,為開拓神經(jīng)保護(hù)治療的新途徑提供實驗依據(jù)。
　　材料與方法:
　　以孕14.5天左右的SD大鼠為研究對象。提取神經(jīng)干細(xì)胞并以DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加2％的B27、20ng/ml的bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、20ng/ml的EGF(表皮生長因子)進(jìn)行培養(yǎng),使用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定,連續(xù)培養(yǎng)3代后,設(shè)置五個干預(yù)組即:空白對照組;IWR-1組、姜黃素組、IWR-1+姜黃素組、DM

6、SO組,采用免疫熒光法檢測各組在干預(yù)72小時時的神經(jīng)元細(xì)胞染色變化;采用Western-blot方法檢測各組在干預(yù)72h時wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)變化;采用RT-PCR法檢測各組在干預(yù)72小時時wnt3a及β-catenin基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第2代時神經(jīng)干細(xì)胞球直徑及成球率明顯增多。免疫細(xì)胞熒光染色證實細(xì)胞部分巢蛋白Nestin陽性,經(jīng)含血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后部分細(xì)胞呈MAP2陽

7、性,部分細(xì)胞呈GFAP陽性,少部分細(xì)胞呈Olig2陽性。
　　2.將神經(jīng)干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3代時分組干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)72小時采用免疫熒光細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)IWR-1組表達(dá)MAP2陽性的神經(jīng)元細(xì)胞比例明顯減少;姜黃素組神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的比例升高,IWR-1聯(lián)合姜黃素組神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化比例較單獨使用姜黃素組減少,且與空白對照組及DMSO組無明顯差異。
　　3.細(xì)胞增值實驗提示,姜黃素可以激活 wnt/β-cate

8、nin信號通路,使神經(jīng)干細(xì)胞向其他神經(jīng)細(xì)胞分化。
　　4. Western blot提示:對神經(jīng)干細(xì)胞分組干預(yù)后,姜黃素組wnt3a、β-catenin表達(dá)量較其他各組明顯升高(P<0.05),IWR-1處理后wnt3a、β-catenin表達(dá)水平較空白對照組明顯降低(P<0.05);IWR-1聯(lián)合姜黃素處理神經(jīng)干細(xì)胞后檢測wnt3a、β-catenin表達(dá)量較姜黃素組減少(P<0.05);DMSO組表達(dá)量接近空白對照組。采用RT

9、-PCR法提示:姜黃素組 wnt3a及β-catenin基因表達(dá)水平較空白對照組表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),IWR-1組神經(jīng)干細(xì)胞中 wnt3a及β-catenin基因表達(dá)水平較空白對照組表達(dá)量下降(P<0.05),基因表達(dá)情況與Western blot結(jié)果相近。
　　結(jié)論:
　　1.給予姜黃素后可以提高神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的分化比例,說明姜黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2.對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)后,使用IWR-