鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)組胺誘導轉(zhuǎn)錄因子激活的機制研究.pdf

1、胞漿游離鈣離子（[Ca2+]I）可作為重要的第二信使在細胞功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用。鈣離子在調(diào)節(jié)細胞功能上具有多樣性，包括細胞的黏附、位移、基因表達、增殖分化。然而，單一的鈣離子是如何實現(xiàn)其功能的特異性呢？這是有關(guān)鈣信號研究的熱點話題。鈣離子濃度升高可表現(xiàn)為多種形式：一過性鈣離子濃度升高，持續(xù)性鈣離子濃度升高，振蕩形式的鈣離子濃度升高。其中鈣振蕩(calcium oscillation)是胞內(nèi)普遍存在的一種信息模式。鈣振蕩(calc

2、ium oscillation)在運動形式上表現(xiàn)為多參數(shù):振幅、頻率、持續(xù)時間等。1998年Lewis等人應用鈣鉗制技術(shù)證明了人工鈣振蕩頻率的變化可特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、NF-AT、OCT/OAP的轉(zhuǎn)錄活性，并可提高鈣離子的工作效率。1999年Hu利用XeC下調(diào)組胺誘導人主動脈內(nèi)皮細胞鈣振蕩頻率，首次證明了受體介導鈣振蕩頻率可特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。鈣振蕩的頻率變化特異性調(diào)節(jié)細胞功能的觀點已被廣泛接受。然而，頻率依賴

3、性的機制是什么呢？經(jīng)仔細觀察發(fā)現(xiàn)，頻率的變化在形式上表現(xiàn)為單位時間內(nèi)胞漿鈣離子濃度（[Ca2+]I）升高與回落的次數(shù)的多少。高頻鈣振蕩時，胞漿鈣離子濃度（[Ca2+]I）在單位時間內(nèi)升高與回落的次數(shù)多，鈣離子在某一濃度持續(xù)的累積時間長，低頻鈣振蕩時與之相反。在生理或病理生理條件下，某些細胞或組織間斷釋放細胞因子（組胺等），以旁分泌或自分泌的形式發(fā)揮作用，從而引起細胞鈣信號的產(chǎn)生亦是間斷性的。據(jù)此推測，鈣振蕩頻率變化的本質(zhì)與累積波寬（鈣離

4、子在某一濃度持續(xù)的累積時間）有關(guān)。在此，本項研究應用組胺間斷刺激人氣道上皮細胞16HBE產(chǎn)生鈣振蕩，建立振幅、頻率相同而累積波寬不同和振幅、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型，并對下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的活性進行測定。發(fā)現(xiàn)振幅、累積波寬相同而頻率不同時，NF-κB的活性的活性相同；振幅、頻率相同而累積波寬不同時，NF-κB的活性的活性亦不相同。由此證明了鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)受體介導激活轉(zhuǎn)錄的本質(zhì)是累積波寬。
　　 目的：本研究通過組

5、胺間斷刺激在人氣道上皮細胞建立振幅、頻率相同而累積波寬不同和振幅、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型，并對下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性的進行檢測，研究鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)下游生物學效應的內(nèi)在機制。
　　 方法：⑴利用本實驗室自行研制的全自動顯微灌流控制系統(tǒng)使有組胺灌流液和無組胺灌液交替對細胞進行灌流，細胞標記有鈣離子熒光指示劑Fura-2，在灌流的同時利用鈣離子成像系統(tǒng)對鈣離子濃度變化進行監(jiān)測，建立鈣振蕩模型。⑵利用本室自行研制的全自

6、動顯微灌流控制系統(tǒng)使有組胺灌流液和無組胺灌流液交替對細胞進行灌流，復制鈣振蕩模型。細胞經(jīng)不同鈣振蕩處理后，用基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子活性檢測方法檢測NF-κB活性。
　　 結(jié)果：⑴在100秒(s)、200s、300s內(nèi)用組胺濃度為10 μmmol的灌流液分別作用于細胞20s、40s、60s，總灌流時間為45 分鐘(min)。三種鈣振蕩的振幅分別為（467.1±57.1）nmol/L（n=21）、（466.8±84.6）nmol/

7、L（n=28）、（467.9±73.2）nnmol/L（n=38），振幅無顯著性差異（p＞0.05）。頻率分別為0.6次/分鐘（min-1）、0.3（min-1）、0.2（min-1）。波寬分別為（18.1±1.6）s（n=13）、（36.0±3.0）s（n=17）、（54.6±2.5）s（n=17）。在45 min的灌流時間內(nèi)，三種頻率的鈣振蕩的累積波寬相同，均為486s；組胺刺激的總時間亦相同，均為540s。由此建立了振幅相同、累積

8、波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型。隨后，改變灌流條件，在100s內(nèi)用組胺濃度為10 μmmol的灌流液作用于細胞30s，灌流液中鈣離子的濃度依次為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,總灌流時間為45 min。三種鈣振蕩的振幅分別為（466.7±58.6）nmol/L（n=29）、（465.3±52.8）nmol/L（n=31）、（466.8±84.5）nmol/L（n=28），振幅無顯著性差異（p＞0.05）。波寬分別為（15

9、.3±1.9）s（n=18）、（20.4±4.1）s（n=24）、（29.6±4.7）s（n=28）,波寬的差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。三種鈣振蕩的頻率均為0.6 min-1。由此建立了振幅相同、頻率相同而累積波寬不同的鈣振蕩模型。以同樣的方式建立頻率分別為0.3 min-1、0.2min-1 振幅相同、頻率相同而累積波寬不同的鈣振蕩模型。⑵振幅相同、累積波寬相同，頻率不同的鈣振蕩對NF-κ B活性的影：用含有10 μmmol組胺

10、的灌流液在100s、200s、300s內(nèi)分別作用于細胞20s、40s、60s，總灌流時間為45 min。NF-κ B的活性分別為（184.7±22.7）%、（157.8±9.1）%、（158.3±12.7）%，空白對照組的活性為100%，三種條件下與空白對照組相比，活性均有明顯升高（p<0.05），但三組之間活性無顯著性差異（p＞0.05）；振幅相同、頻率相同，累積波寬不同的鈣振蕩對NF-κ B活性的影：用含有10 μmmol組胺的灌流

11、液在100s內(nèi)作用于細胞30s，分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol 三種不同的灌流液作用，總灌流時間為45 min。NF-κB的活性分別為（144.4±6.1）%、（209.1±22.2）%、（394.3±65.4）%，空白對照組的活性為100%，三種條件下與空白對照組相比，活性均有明顯升高（p<0.05）,三組間的活性有顯著性差別（p<0.05）。用含有10 μmmol組胺的灌流液在200s內(nèi)作用于細胞3

12、0s，分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol 三種不同的灌流液作用，總灌流時間為45 min。NF-κB的活性分別為（126.7±12.2）%、（147.6±13.9）%、（198.6±26.3）%?？瞻讓φ战M的活性為100%，三種條件下與空白對照組相比，活性均有明顯升高（p<0.05）。其中 1.0mmol組和1.5mmol組NF-κ B活性的差別無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；1.0mmol組和 2.0mmo

13、l組 NF-κ B活性的差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05），1.5mmol組和2.0mmol組NF-κB活性的差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。用含有10 μmmol組胺的灌流液在300s內(nèi)作用于細胞30s，分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol 三種不同的灌流液作用，總灌流時間為45 min。NF-κ B的活性分別為（111.4±7.0）%、（113.0±3.2）%、（119.6±9.8）%，三種條件下與空白對

14、照組相比，活性均有明顯升高（p<0.05）。三組間兩兩比較NF-κ B活性的差別無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。組間對照用無組胺灌流液灌流細胞，鈣離子濃度分別為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol，三組間NF-κ B的活性無顯著性差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論：本實驗在人氣道上皮細胞中成功地建立了振幅、頻率相同，累積波寬不同以及振幅、累積波寬相同，頻率不同的鈣振蕩模型。為研究鈣振蕩如何調(diào)節(jié)NF-κ B活性奠定了基礎(chǔ)。