慢病毒介導(dǎo)的miR-210對豬急性心肌梗死血管新生影響及機(jī)制的研究.pdf

1、急性心肌梗死是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠脈內(nèi)粥樣斑塊破裂引起冠脈急性閉塞并導(dǎo)致前向血流中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血、缺氧導(dǎo)致心肌壞死的臨床綜合征。AMI的治療方法包括藥物治療（冠脈溶栓等）、介入（支架）治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)等。發(fā)展較快的治療方式對改善AMI的預(yù)后起到了積極的作用，但AMI仍嚴(yán)重威脅著人類的生命安全，臨床上必須高度重視，緊急處理并尋求最佳治療方法。
　　梗死區(qū)內(nèi)是否有血管迅速生成或殘留的血管是否重新

2、開放與心肌梗死的修復(fù)過程密切相關(guān)，心梗后快速建立良好的側(cè)支循環(huán)來改善梗死區(qū)血液供應(yīng)，促進(jìn)梗死區(qū)心肌細(xì)胞存活具有非常重要的意義。血管生成是指在原有血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程。血管生成是一個多步驟受到嚴(yán)密調(diào)控的復(fù)雜過程，這些調(diào)控主要通過以 VEGF為代表的多種因子在時間和空間上協(xié)同作用，共同促進(jìn)血管生成的進(jìn)行。近年來，隨著對AMI梗死區(qū)血管新生和血管生長因子研究的不斷深入，通過調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)來刺激缺血區(qū)微血管生成

3、，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立便成了AMI治療的十分誘人且直觀合理的方法。
　　微小RNA(microRNA,miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種長度為18~26核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA，其序列高度保守，通過與靶基因序列特異性相互作用，介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄模板的降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響包括發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學(xué)過程。miRNA表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)足以引起一些特異性的心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，通過糾正那

4、些異常表達(dá)的miRNA可以為某些心血管疾病的治療提供新方向。miR-210是血管內(nèi)皮上的特殊的miRNA，其靶基因Ephrin-A3是VEGF介導(dǎo)血管新生信號通路的重要信號分子，miR-210在心梗后的血管發(fā)生和維持血管的完整性上起著重要作用。
　　我們推測miR-210通過靶基因EphrinA3影響VEGF信號通路并調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，刺激梗死及邊緣區(qū)血管生成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成。為此，我們擬將穩(wěn)定過表達(dá)miR

5、-210的慢病毒載體首先體外應(yīng)用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究其對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響；然后注射入小型豬急性心梗模型梗死及邊緣區(qū)，研究其對心梗小型豬心功能及血管生成的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行評估和探討，以期望為AMI治療探索一條新途徑。
　　第一部分、miR-210慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及包裝
　　目的：
　　通過基因工程技術(shù)將miR-210前體序列克隆至pLVTHM慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建pLVTHM/miR-2

6、10慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)研究miR-210對豬急性心肌梗死血管新生的影響及機(jī)制提供了良好的載體。
　　方法：
　　由miRBase數(shù)據(jù)庫獲得pre-ssc-miR-210序列，利用聚合酶鏈反應(yīng)從豬基因組中擴(kuò)增miR-210的前體；將miR-210前體序列和pLVTHM載體經(jīng)Mlu I和Cla I雙酶切后連接，構(gòu)建pLVTHM/miR-210重組慢病毒表達(dá)載體。雙酶切和測序鑒定，篩選陽性克隆；以pLVTHM/miR-210、

7、psPAX2和pMD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染并包裝HEK-293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒并測定滴度。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)雙酶切鑒定和測序證實，成功構(gòu)建了包含miR-210的慢病毒表達(dá)載體pLVTHM/miR-210；倒置熒光顯微鏡下觀察可見包裝細(xì)胞HEK-293T表達(dá)綠色熒光。慢病毒滴度測定結(jié)果顯示病毒滴度符合繼續(xù)實驗要求。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了包含miR-210的慢病毒表達(dá)載體pLVTHM/miR-210，成功進(jìn)行

8、病毒包裝，病毒滴度符合實驗要求，為進(jìn)一步深入研究miR-210對豬急性心肌梗死血管新生的影響及機(jī)制提供了良好的載體。
　　第二部分、pLVTHM/miR-210體外轉(zhuǎn)染促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及分化作用的研究
　　目的：
　　研究pLVTHM/miR-210載體能否有效感染內(nèi)皮細(xì)胞，以及過表達(dá)miR-210對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響。
　　方法：
　　pLVTHM/miR-210慢病毒感染血管

9、內(nèi)皮細(xì)胞，CCK-8實驗測定各組細(xì)胞增殖情況；Transwell小室檢測各組細(xì)胞遷移能力；血管形成實驗檢測各組細(xì)胞血管形成能力；qPCR檢測各組細(xì)胞miR-210表達(dá)相對含量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同組別細(xì)胞上清液中VEGF含量。
　　結(jié)果：
　　pLVTHM/miR-210慢病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞效率在70％以上，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差別；CCK-8檢測結(jié)果顯示miR-210組細(xì)胞生長曲線上升較為迅速，增殖速度顯著高于空載體組及

10、對照組，72h為miR-210組內(nèi)皮細(xì)胞增殖高峰期；Transwell小室檢測結(jié)果顯示miR-210組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著高于空載體組及對照組；不同組別血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel膠中檢測血管形成能力，結(jié)果顯示miR-210組管狀分枝點數(shù)顯著高于空載體組及對照組；qPCR檢測結(jié)果顯示miR-210組血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-210相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于對照組及空載體組；miR-210組細(xì)胞上清液中VEGF含量顯著高于空載體組及對照組。
　　結(jié)

11、論：
　　pLVTHM/miR-210能有效感染內(nèi)皮細(xì)胞。miR-210促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力可能與miR-210促進(jìn)ECs分泌VEGF密切相關(guān)。
　　第三部分、小型豬急性心肌梗死模型的建立及評價
　　目的：
　　結(jié)扎小型豬冠狀動脈左前降支(Left Anterior Desending Branch,LAD)建立急性心肌梗死模型，并評價其效果。
　　方法：
　　選取實驗用小豬8只，

12、常規(guī)全身麻醉，氣管插管，平臥于導(dǎo)管室手術(shù)臺，四肢妥善固定，并同時給予實時心電監(jiān)護(hù)、血壓監(jiān)測，置入經(jīng)食管超聲探頭，連接心臟超聲儀。全身肝素化，經(jīng)股動脈穿刺并留置鞘管，先行冠狀動脈造影（Coronary Artery Angiography，CAG）證實其左前降支及其他冠狀動脈通暢，無狹窄或閉塞等病變。左前胸局部備皮，開胸，打開心包，顯露冠狀動脈左前降支，在第一對角支遠(yuǎn)端約1.5~2cm處以縫線結(jié)扎左前降支，構(gòu)建急性心肌梗死模型。心電監(jiān)護(hù)及

13、描圖提示多個導(dǎo)聯(lián)ST段明顯弓背向上抬高，結(jié)扎部位以遠(yuǎn)左室前壁及心尖部顏色變暗、變紫、變白，心尖部室壁運(yùn)動明顯減弱或消失，冠狀動脈造影顯示左前降支完全梗阻，證明造模成功。止血，關(guān)胸。待豬自主呼吸恢復(fù)后拔除氣管插管。檢測術(shù)前及術(shù)后24h心肌損傷標(biāo)志物CK、CK-MB、cTnI等。術(shù)后2d開始進(jìn)食，術(shù)后3d內(nèi)給予抗生素。術(shù)后第2周，復(fù)查經(jīng)食管超聲心動圖、冠狀動脈造影及心肌核素灌注顯像（Emssion Computed Tomography,E

14、CT）檢查；術(shù)后第6周（實驗結(jié)束后），全麻后靜脈注射氯化鉀，處死動物，剖出心臟，取出左前降支供應(yīng)區(qū)域的缺血區(qū)及正常區(qū)左心室心肌，行相關(guān)病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　8頭小型豬中有6頭存活，成活率75%。冠狀動脈左前降支完全結(jié)扎、血流阻斷后，可見心電圖ST段下斜形或弓背狀抬高，持續(xù)0.5h，為急性心肌梗死心電圖表現(xiàn)。前降支結(jié)扎24h后血清心肌酶譜(CK、CK-MB、cTnI)較術(shù)前顯著增高2倍以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.0

15、5)；經(jīng)食管超聲心動圖檢查結(jié)示造模后與造模前比較實驗動物心功能明顯降低：EF、FS顯著降低，LVESD、LVEDD、LVEDV等顯著增大，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；冠狀動脈造影顯示造模后左前降支血流完全中斷，TIMI血流分級為0級；ECT示前降支遠(yuǎn)段支配區(qū)域較術(shù)前明
　　顯灌注缺損；術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示梗死區(qū)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、排列不齊，肌細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，細(xì)胞分界不清楚。
　　結(jié)論：
　　利用冠狀動

16、脈結(jié)扎法制備小型豬急性心肌梗死模型，心電監(jiān)護(hù)顯示ST段弓背向上抬高持續(xù)0.5h；心肌酶學(xué)CK、CK-MB和cTnI均增高2倍以上；超聲心動圖顯示心功能顯著減低；冠狀動脈造影顯示左前降支中遠(yuǎn)段結(jié)扎部位處完全閉塞；心肌ECT示前降支中遠(yuǎn)段供應(yīng)區(qū)域明顯灌注缺損。成功建立了小型豬急性心肌梗死模型。
　　第四部分、pLVTHM/miR-210對急性心肌梗死血管新生的影響及機(jī)制的研究
　　目的：
　　將pLVTHM/miR-210

17、注射到小型豬心肌梗死及邊緣區(qū)，4周后通過經(jīng)食道超聲心動圖、冠狀動脈造影、心肌核素灌注顯像、梗死區(qū)域新生血管密度及Ephrin-A3與VEGF等相關(guān)指標(biāo)及參數(shù)的觀察，探討miR-210對小型豬急性心肌梗死區(qū)血管新生的影響與機(jī)制。
　　方法：
　　小型豬開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支2周后，將AMI模型動物隨機(jī)分為3組：I.模型組，在左心室前壁梗死及梗死邊緣區(qū)心肌分10點將PBS注射到梗死區(qū)域，每點間隔1cm；II.空載體組，將 pLV

18、THM空載體點狀注射到梗死區(qū)域；III. miR-210組，將pLVTHM/miR-210點狀注射到梗死區(qū)域（1X1011virus particles/點），治療后4w復(fù)查經(jīng)食管超聲心動圖、冠脈造影及心肌核素灌注顯影，開胸取出心臟進(jìn)行心臟病理改變檢測，留取標(biāo)本熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)；酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測血清中ET及VEGF的含量的變化；免疫組化檢測CD31因子特異性內(nèi)皮標(biāo)記，同時利用 RT-PCR及免疫印跡測定各組中Ephrin

19、-A3、VEGF mRNA及蛋白含量。
　　結(jié)果：
　　移植4周后，經(jīng)食管超聲心動圖結(jié)果顯示 miR-210組心功能均較移植前有明顯改善，各項指標(biāo)均與模型組存在統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異(p>0.05)；冠脈造影結(jié)果顯示miR-210組梗死區(qū)有相對明顯的細(xì)小側(cè)枝形成，miR-210組TIMI評級高于模型組，存在統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異(p>0.05)；心肌ECT提

20、示miR-210組缺損面積百分比均低于模型組及空載體組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異(p>0.05)；熒光顯微鏡檢查結(jié)果顯示，miR-210組小型豬心肌梗死區(qū)組織切片可見綠色熒光，模型組無任何熒光；酶免實驗結(jié)果顯示miR-210組血清中ET-1顯著低于模型組及空載體組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異(p>0.05)；VEGF含量則顯著增加；CD31染色可見miR-210組

21、缺血心肌組織的血管新生均明顯增強(qiáng)，顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異(p>0.05)；RT-PCR及免疫印跡結(jié)果顯示miR-210組梗死區(qū)組織中Ephrin-A3 mRNA及蛋白顯著低于模型組，有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異(p>0.05)；miR-210組梗死區(qū)組織中VEGF mRNA及蛋白顯著高于模型組，有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，模型組與空載體組無顯著性差異