基于IGF2基因組印跡丟失的5型重組腺病毒靶向治療結(jié)直腸癌的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　構(gòu)建攜帶胰島素樣生長因子2印跡(IGF2 Imprinting)系統(tǒng)的重組腺病毒，探討其用于靶向治療人結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)細(xì)胞株的可行性。
　　研究方法:
　　(1)使用PCR擴增人源IGF2 Imprinting相關(guān)的結(jié)構(gòu)元件，包括H19啟動子序列、enhancer及CTCF片段，并將其克隆到pDC-312載體中，最終構(gòu)建IGF2Imprinting系統(tǒng);
　　

2、(2)從質(zhì)粒TopK和pEGFP-C1 vector中分別擴增出E1A和EGFP片段，并將其插入到含有IGF2 Imprinting系統(tǒng)的重組質(zhì)粒中，用于構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒;
　　(3)Top10感受態(tài)細(xì)胞通過擴增和純化，將腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-E1A，骨架質(zhì)粒Ad5通過脂質(zhì)體Lipo2000共轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞（HEK293）中，包裝成具有感染能力的腺病毒Ad-H19-CTCF-enhancer-E1A和Ad-H19-C

3、TCF-enhancer-EGFP，分別命名為Ad312-E1A和Ad312-EGFP;
　　(4)利用腺病毒Ad312-EGFP分別感染IGF2印記丟失(IGF2 LOI)的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29和HCT-8及IGF2印跡正常(IGF2 MOI)的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和正常人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1，通過熒光顯微鏡觀察不同細(xì)胞中EGFP的表達情況;
　　(5)使用已上市的溶瘤腺病毒H101作為陽性對照，將Ad312-E

4、1A和H101感染不同的細(xì)胞株，48 h后采用RT-PCR和Western Blot分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測各組細(xì)胞中E1A的mRNA及其蛋白的表達量;同時，采用CCK-8法和流式細(xì)胞儀用以檢測腺病毒Ad312-E1A的體外殺傷腫瘤效應(yīng);
　　(6)構(gòu)建裸鼠腋下移植瘤模型，驗證Ad312-E1A的體內(nèi)殺傷腫瘤效應(yīng)。
　　研究結(jié)果:
　　(1)成功轉(zhuǎn)染了穿梭質(zhì)粒pDC312-E1A和骨架質(zhì)粒Ad5到HEK293細(xì)胞中，E

5、GFP在48 h表達最強;10-13 d，細(xì)胞病變效應(yīng)為陽性結(jié)果，通過3輪病毒的擴增達到了合適的病毒滴度（1×109pfu/ml）;
　　(2)利用重組腺病毒Ad312-EGFP分別感染不同的細(xì)胞株，48 h觀察，IGF2 LOI的細(xì)胞株(HT-29、HCT-8)出現(xiàn)了明顯的熒光，即表達了EGFP;
　　(3)利用重組腺病毒Ad312-E1A分別感染不同的細(xì)胞株，48 h后發(fā)現(xiàn)E1A的mRNA和蛋白僅僅在IGF2 LOI細(xì)胞

6、(HT-29、HCT-8)中表達;與正常對照PBS組相比，72 h后10 pfu/cell感染的IGF2 LOI細(xì)胞（HT-29、HCT-8）增殖活力分別下降（69.7±5.7）％和（65.2±7.1）％，凋亡率達到（33.4±4.1）％和（29.5±2.7）％;溶瘤腺病毒H101感染細(xì)胞株后，僅在p53突變的IGF2 LOI細(xì)胞(HT-29)中出現(xiàn)E1A mRNA和蛋白表達，72 h后10 pfu/cell感染的HT-29細(xì)胞增殖活率

7、下降（59.4±2.4）％，凋亡率為（38.6±3.2）％;
　　(4)多點注射PBS、Ad312-EGFP、H101和Ad312-E1A治療HT-29細(xì)胞種植的裸鼠移植瘤，結(jié)果顯示腺病毒H101和Ad312-E1A均能有效的抑制腫瘤的生長并改善其預(yù)后。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究成功的構(gòu)建了攜帶IGF2 Imprinting系統(tǒng)和腺病毒復(fù)制基因E1A的重組腺病毒;
　　(2)重組腺病毒Ad312-E1A在體內(nèi)